【摘 要】
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转录是基因表达的第一阶段,并且是基因调节的主要阶段.转录的顺利进行一般都需要转录辅助因子的协助.PC4是介导上游激活子与通用转录机制相互作用的转录辅助因子.它能够
【机 构】
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中国农业大学农学与生物技术学院植物病理学系,北京100193
【出 处】
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中国植物病理学会第十二届青年学术研讨会
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转录是基因表达的第一阶段,并且是基因调节的主要阶段.转录的顺利进行一般都需要转录辅助因子的协助.PC4是介导上游激活子与通用转录机制相互作用的转录辅助因子.它能够和多种转录因子相互作用,参与许多基因的调控.PC4是酵母Sub1同源的蛋白,它们能够结合ssDNA,参与转录的起始、延伸、DNA损伤修复以及活性氧的耐受等多种生理生化过程.该蛋白在稻瘟菌中的同源蛋白为MoSub1,为了深入地了解MoSub1在稻瘟菌中调控转录的分子机制,作者着重研究了磷酸化对Mo-Sub1的ssDNA结合活性的影响.研究表明,磷酸化对于酵母Sub1以及人源PC4的DNA结合活性有着不同的影响.实验室前期也鉴定了MoSub1的几个磷酸化位点,包括S14、S17、S119、S151、S155等.为了研究磷酸化作用如何影响稻瘟病菌中MoSub1与DNA的结合活性,作者将上述5个磷酸化丝氨酸位点突变为谷氨酸,构建了Mo-Sub1 5SE突变体,用来模拟MoSub1的磷酸化状态.同时构建了CKⅡ激酶表达载体,将hCKⅡα催化亚基与MoSub1进行共表达,获得CKⅡ激酶磷酸化的MoSub1p,命名为MoSub1 CKⅡ.首先作者使用各种层析技术(包括亲和层析、离子交换层析及凝胶排阻层析等)对各重组蛋白进行了纯化,并对纯化缓冲液组成(pH、离子强度及添加剂等)和层析策略等进行了优化以获得高纯度有活性的目的蛋白.然后,通过圆二色谱(CD)实验证明了5SE突变对MoSub1的二级结构没有明显的影响.利用等温滴定量热(ITC)实验检测了MoSub1、MoSub1 5SE和MoSub1 CKⅡ与寡聚核苷酸dT20的结合活性,结果表明它们的化学计量比均为2,解离平衡常数Kd均在0.4 μmol/L左右.这表明磷酸化对于MoSub1与ssDNA的结合力没有明显影响,正在开展磷酸化对Mo-Sub1 ssDNA结合的动力学影响的研究.
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