研究背景:细胞因子对于人体的免疫应答、炎症反应和肿瘤发生有重要的调节作用,并且越来越多的细胞因子已经用于临床治疗,发现潜在新细胞因子的工作显得尤为重要。为了发现和鉴定新的潜在细胞因子,从2008年开始,北京大学免疫学系与国家人类基因组北方研究中心合作,采用免疫基因组学策略,开展了人类潜在新细胞因子的生物信息学遴选、功能筛选和系统性功能研究,发现了多个潜在新细胞因子。CYTL1(cytokinelike 1)即为其中之一。我们已证实CYTL1是一个分泌蛋白。为了进行更深入的功能研究,我们构建了真核表达载体pMH3-IgkCYTL1-His,获得了高效稳定表达CYTL1的CHO细胞株(中国仓鼠卵巢细胞),表达并纯化了CYTL1蛋白。目的:建立高效稳定表达人CYTL1-his融合蛋白的CHO细胞,获得大量重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法:从表达CYTL1-myc-his融合蛋白的载体中扩增其cDNA片段,利用重叠PCR方法将此片段与IgK信号肽序列(N端)连接融合,将其克隆到高效真核表达载体pMH3中(pMH3载体由杭州安瑞普生物科技有限公司提供)。利用电击转染的方法将该质粒转染CHO细胞,用G418筛选抗性克隆,通过Dot blot及Western blot法鉴定其表达水平及免疫学活性。挑选高表达的一次克隆进行亚克隆化。细胞株扩大培养,悬浮驯化后进行无血清大批培养获得表达丰收液。结果:经核酸测序及酶切鉴定,高效重组CYTL1表达载体构建成功。此载体转染CHO细胞后经2次克隆化获得至少6株高效稳定表达融合蛋白的基因工程细胞株,Dot blot分析显示其表达水平最高的细胞株24h贴壁表达量可达2.5mg/L。Western blot分析显示,其分子量约为19kDa,与预期融合蛋白大小基本一致。结论:获得了高效稳定表达CYTL1的CHO细胞株。