【摘 要】
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目的 筛选并鉴定转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞特化心肌样细胞过程中Islet-1募集的组蛋白乙酰化复合体；明确Islet-1在C3H10T1/2细胞特化乙酰化心肌样细胞调控网络中的关键枢纽作用.方法 采用倒置相差显微镜观察转染Islet-1慢病毒载体后的各组C3H10T1/2的细胞形态.免疫荧光细胞化学检测Islet-1在C3H10T1/2细胞的表达部位,Western-bl
【机 构】
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重庆医科大学附属儿童医院、重庆医科大学儿科研究所、儿童发育疾病研究教育部重点实验室
【出 处】
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中华医学会2012年医学遗传学年会暨全国第十一次医学遗传学学术会议
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目的 筛选并鉴定转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞特化心肌样细胞过程中Islet-1募集的组蛋白乙酰化复合体；明确Islet-1在C3H10T1/2细胞特化乙酰化心肌样细胞调控网络中的关键枢纽作用.方法 采用倒置相差显微镜观察转染Islet-1慢病毒载体后的各组C3H10T1/2的细胞形态.免疫荧光细胞化学检测Islet-1在C3H10T1/2细胞的表达部位,Western-blot检测诱导组Islet-1各时间点表达情况和各实验组(诱导组、空白对照组、C3H10组)Islet-1表达量的差异.Co-IP沉淀Islet-1募集的蛋白复合体,SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色、脱色,HPLC-CHIP-NanoSpray-ESI-MS/MS筛选鉴定Islet-1募集的蛋白复合体.从组蛋白乙酰化相关蛋白及信号转导相关蛋白角度,用swiss-port、ExpAsy数据对步骤3中质谱结果进行生物信息学分析.Western-blot验证与Islet-1相互作用的HATs和HDACs及FGF信号转导途径相关蛋白.结果 诱导组细胞及空白对照组细胞感染Islet-1慢病毒后4天可检测到有绿色荧光蛋白表达.诱导组细胞慢病毒转染效率为88.82％,空白对照组细胞慢病毒转染效率为90.12％.诱导组细胞在转染慢病毒培养3周后细胞排列整齐,细胞形态一致,成纤维细胞样,立体感强.空白对照组细胞则在培养3周后排列散乱无规则,成短棒状.C3H10组细胞培养3周后形态无明显变化.各实验组Islet-1主要表达在C3H10细胞胞质内,诱导组荧光强度(5707.220±174.20)显著高于空白对照组(239.584±6.321)及C3H10组(241.377±6.197)(P＜0.05).诱导组Islet-1表达量在3周(0.782±0.015)和4周(0.780±0.034)时显著高于1周(0.127±0.006)和2周(0.128±0.004)(P＜0.05).3周、4周Islet-1表达无显著差异(P＜0.01).诱导组Islet-1表达量(0.819±0.026)显著高于空白对照组(0.127±0.006)及C3H10组(0.126±0.001)(P＜0.05).3.诱导组Islet-1表达量显著高于空白对照组及C3H10组(P＜0.05),各实验组经过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝分离染色,排除非特异性条带后,得到7条质谱条带.通过质谱鉴定和分析蛋白相关生物信息学数据得到Islet-1募集的蛋白复合物为：DNA连接蛋白和FGF信号蛋白.Western-blot验证实验结果：(1)Islet-1募集的复合体中存在组蛋白乙酰化相关蛋白：GCN5、P300/CBP、PCAF和HDAC4、HDAC5.(2)FGF10信号蛋白：FGF10及其受体FGF2rb也存在于Islet-1募集的复合体中.结论 1.Islet-1与HATs和HDACs相互作用特异性辅助C3H10T1/2细胞分化为心肌样细胞.Islet-1与FGF10直接结合促进C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化.
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