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目的:(1)探索神经系统变性疾病(Neurodegenerative diseases,NDD)患者脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)诱导人间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)定向分化为神经干细胞(Nepal stem cells,NSCs)的可行性,并观察、比较不同诱导剂(CSF、生长因子)诱导不同来源间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分化为NSCs的天数及细胞数,从而为有干细胞治疗需求的NDD患者提供临床适用、实用的MSCs体外扩增、定向分化方案。(2)观察、对比不同来源hMSCs(骨髓源、脐血源)及其经CSF诱导获得的NSCs通过腰椎穿刺鞘内注射(Lumbar puncture intrathecal iniection,LP-II)的方法移植治疗NDD的临床疗效和安全性,从而为有干细胞治疗需求的特定患者提供适用、实用的个体化干细胞治疗模式。方法:在知情同意的前提下,根据纳入和排除标准,纳入有干细胞治疗需求的NDD患者为试验对象。骨髓细胞学分析后对其进行分组:其中细胞增生程度、细胞计数、细胞比例正常者进入骨髓源干细胞治疗组,设为A组;否则进入脐血源干细胞治疗组,设为B组。在分出A、B组后进行:(1)A组者取自身骨髓获取骨髓源间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells,BMMSCs),B组者取足月健康顺产新生儿获取脐血源间充质干细胞(Umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCBMSCs),并用倒置显微镜和电镜观察、流式细胞分析、免疫组化和荧光免疫组化分析及反转录聚合酶链反应分析等方法对目的细胞进行鉴定,并记录目的细胞达临床可用数量级(107/ml)时所需的时间及所获得具体细胞计数。(2)将获得MSCs,取一定量,通过LP-II法对患者进行首次干细胞移植治疗,治疗前需对患者用特定神经功能量表(PD-UPDRS、Dementia-MMES、MND-改良Norris、MSA—ICARS),生活活动能力量表(BI)及生活质量量表(EuroQOL)等量表进行评估;同时,在注射细胞前需先留取一定量的CSF离心备用。移植后观察患者是否有副反应及并发症,并记录。(3)A、B两组获得MSCs后再各分出两组,记为A1、A2、B1、B2四组,A1组为BMMSCs+CSF诱导组,A2组为BMMSCs+生长因子诱导组,所用MSCs来自A组NDD患者自身,且A1组所用CSF亦来自A组NDD患者自身(首次移植鞘内注射干细胞前获得);B1组为UCBMSCs+CSF诱导组,B2组为UCBMSCs+生长因子诱导组,所用MSCs均来自足月健康顺产新生儿,而B1组所用CSF来自B组NDD患者(首次移植鞘内注射干细胞前获得)。参照我们的专利及既往相关文献方法,对A1、A2、B1、B2四组,进行诱导,并用倒置显微镜和电镜观察、流式细胞分析、免疫组化和荧光免疫组化分析及反转录聚合酶链反应分析等方法对目的细胞进行鉴定,并记录目的细胞达临床可用数量级(107/ml)时所需的时间及所获得具体细胞计数。(4)将A1、B1两组获得NSCs,取一定量,通过LP-II法对患者进行第二次干细胞移植治疗,注射细胞前亦需先留取一定量的CSF离心备用。移植后亦需观察患者是否有副反应及并发症,并记录。(5)如果患者需要进行多次移植治疗,可循环以上步骤,实现一次LP-II完成"获取诱导剂与实施治疗"两件事;同时亦可将目的细胞冻存以备患者后用。(6)当完成移植治疗后,需在首次治疗后3个月、6个月对患者随访,观察、记录其神经功能的恢复情况(所用量表同治疗前)及移植术后的不良反应,并与前进行比较。结果:(1)共纳入试验对象NDD患者14人,其中骨髓源干细胞治疗组即A组8人(6男2女);脐血源干细胞治疗组即B组6人(6男0女)。两组在性别比例、平均年龄无统计学差异(P>0.05)。(2)A、B两组患者获取临床可用数量级所需的时间及所获得MSCs的细胞数无统计学差异(P>0.05)。(3)A1、A2、B1、B2四组的MSCs经诱导后均呈现神经干细胞改变,均可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。并表现相应的特征形态结构、表型和生物学特性。而A1组所获得神经干细胞计数最高,平均为2.49±0.39×10^7/ml,且有统计学差异(P<0.05):同时,其所需时间相对较短,平均为13.25±2.82天,且有统计学差异(P<0.05)。(4)A、B两组患者在移植干细胞的平均次数及平均数量上无统计学差异(P>0.05)。(5)移植后可见A、B两组患者的神经功能均得到不同程度的改善;移植前及首次移植后3月、6月A、B两组患者间的日常生活活动能力量表(Barthel Index,BI)及欧洲生活质量评分量表(Europe quality of life scale,EuroQOL)得分比较均无统计学差异(P>0.05),但各组组内不同时间点上的BI、EuroQOL得分有统计学差异(P<0.05),说明患者接受干细胞移植治疗后BI、EUROQOL的得分有随时间变化的趋势(P<0.05),而时间和分组的交互作用没有统计学意义(P>0.05),提示时间因素的作用不随分组的不同而不同。(6)移植术后有3例出现过短暂性低热,2例出现在A组,1例出现在B组,对症处理即可控制;随访至今最长者己达2年,这其中无一例患者出现继发性肿瘤等干细胞移植严重并发症;有4例在随访过程中死于其它疾病,1例出现在A组,死于心源性猝死,3例出现在B组,均死于继发性肺部感染。结论:(1)NDD患者的CSF可诱导自体骨髓源和异体脐血源MSCs定向分化为NSCs,所获得的细胞数亦可满足临床需要(与当下较流行的生长因子诱导法比),符合NDD患者的治疗需要。(2)NDD患者自体骨髓源、异体脐血源MSCs及其经CSF诱导获得的NSCs移植治疗NDD安全,未见明显严重治疗副反应及相关并发症出现。(3)骨髓源干细胞和脐血源干细胞移植治疗能促进NDD患者神经功能的恢复,并使NDD患者的日常生活活动能力、生活质量得到改善,但两种来源的干细胞对NDD患者日常生活活动能力、生活质量的改善程度无明显差异,提示当有干细胞治疗需求的患者自身骨髓条件不允许的情况下,亦可尝试脐血源干细胞移植治疗。(4)一次腰穿实现"获取诱导剂与实施治疗"双得的循环型个体化干细胞治疗模式符合NDD患者的干细胞治疗需求,是一种临床将来可以推广的适用、实用的个体化干细胞治疗模式。