【摘 要】
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人类基因治疗和转基因动物等都需要外源基因高效、持续稳定表达,本课题组前期建立了独特的多位点基因打靶技术,获得稳定表达的靶位点,但其基因定点插入效率需要进一步提
【机 构】
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佛山科学技术学院医学院,佛山528000
【出 处】
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广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会
论文部分内容阅读
人类基因治疗和转基因动物等都需要外源基因高效、持续稳定表达,本课题组前期建立了独特的多位点基因打靶技术,获得稳定表达的靶位点,但其基因定点插入效率需要进一步提高.转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一项高效在体基因组编辑技术,拥有定点插入效率高、细胞毒性低的诸多优势.本研究利用在线软件在入基因组rDNA基因序列上寻找到合适的TALEN切割位点,构建以TALEN切割位点为靶位点的人类细胞通用多位点基因打靶载体,该打靶载体包含左右同源重组引导序列DS1和DS2(TALEN切割位点两侧基因序列)以及标记蛋白表达元件.我们以健康人外周血的基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增DS1和DS2并利用酶切位点HindⅢ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ分别将两个基因插入到pUC-19多克隆位点中,得到重组质粒pUC-DS1-DS2.采用In-fusion酶将从真核表达载体pEGFP-N1中扩增EGFP表达元件(pCMV-MCS-EGFP)连接到经Pst Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pUC-DS1-DS2得到的线性化载体.最终,经酶切鉴定和测序验证,成功构建了人类细胞通用多位点打靶载体"pUC-DS1-pCMV-MCS-EGFP-DS2".本研究将最新的TALEN技术与本组前期建立的多位点打靶相结合,所构建的通用多位点打靶载体,有望进一步提高基因定点插入效率,可用于不同细胞的基因打靶,为动物转基因和人类疾病基因治疗等工作奠定基础.
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