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目的:建立肝癌标志物高尔基体蛋白73(GP73)的临床检测方法,探讨其单独及与血清中甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)对原发性肝癌(PHC)诊断的意义,为PHC的临床诊疗提供更多依据。方法:根据报道的GP73全基因序列设计、合成巢式PCR引物,从HepG2细胞中分离扩增出GP73的基因片段。将该片段克隆到p ET-28载体中,经序列分析后,将该重组载体转染至大肠杆菌BL21中,并诱导表达、纯化后,免疫新西兰白兔制备多抗,同时按常规方法免疫Bablc小鼠,建立杂交瘤细胞系,筛选和制备单抗。采用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(H RP)标记纯化的多抗。将纯化后的单抗按常规方法包被酶联板,按常规ELISA方法,分别加入肝癌患者血清温浴后,再加入酶标多抗温浴后,加入底物显色,建立血清了双抗体夹心ELISA检测GP73的方法。随机选取105例治疗前HCC患者、570例疑似肝癌病例、100例慢性肝炎患者、490例献血员标本,分别进行GP73、AFP和AFP-L3的检测,并计算AFP-L3占AFP总量的百分含量。同时,针对首次未诊断肝癌的75肝硬化患者进行了1年的随访检测研究。结果:成功分离了GP73基因序列分析与报道序列同源性100%;WB结果显示表达产物具有较好的免疫反应性。AFP以400ng/ml、AFP-L3以10%、GP73以150ng/ml为临界值,AFP检测肝癌、高危人群、慢性肝炎、健康献血员其阳性率分别为34.2%、6.49%、4%、0.8%;AFP-L3%为39.0%、12.28%、0、0;GP73为55.2%、47.2%、3%、0.6%;联合检测阳性率分别为75.2%、52.45%、6%、1.4%。随访研究中GP73首次检测阳性组1年内发生肝癌的比例为57.14%(16/28),阴性组为6.38%(3/47),阳性率差距8.95倍。结论:成功获得GP73基因片段、表达了重组蛋白、免疫动物并获得了多抗及单抗、建立了ELISA检测方法 ;统计分析表明GP73对HCC诊断具有较好的灵敏度,AFP-L3具有较高的特异性。血清GP73、AFP和AFP异质体联合检测,可有效提高HCC的临床诊断;随访研究表明GP73检测对肝癌的早期诊断有重要意义。