高压快速冷冻电镜技术及在神经生物学研究中的应用

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电镜技术在神经生物学中的应用已有五十多年的历史,为神经生物学在形态结构方面的研究带来了一场革命,突触(synapse)的发现就是一个典型的例子,它结束了自十九世纪末至二十世纪五十年代近半个世纪有关神经元之间是否有直接联系的神经生物学世纪之争。常规电镜技术需要先用甲醛、戊二醛等化学试剂对样品进行化学固定,但化学固定有以下三个方面的缺点,一是固定过程至少需要数分钟,而机体内的许多生理过程都非常短暂,仅持续数秒甚至毫秒,如神经元突触小泡内神经递质的释放,用传统化学固定方法无法扑捉到这些生理过程的形态学变化和特征;二是包埋前需要用酒精等有机溶剂对样品进行脱水,这一过程会造成细胞和组织皱缩,使其形态和大小发生改变;三是化学固定剂特别是戊二醛可引起蛋白质变性,造成蛋白质抗原特性改变,使其与相应抗体的结合能力下降甚至丧失,导致电镜免疫组化染色失败。为克服化学固定以上缺点上世纪九十年代末瑞士科学家Studer博士发明了一种新的物理性电镜固定技术,称为高压快速冷冻电镜固定技术,利用该技术可以在不使用任何化学固定剂的条件下在五十毫秒之内将组织和细胞完全固定,然后既可通过常规电镜包埋和超薄切片后进行超微结构观察和研究,也可通过冰冻替代技术包埋和切片后进行包埋后免疫胶体金染色(post-labeling),对蛋白质进行超微结构下的定位定量研究。虽然高压快速冷冻固定技术克服了化学固定的三大缺点,但它本身也有一个缺点,即固定的样品非常小,直径不能超过1毫米,厚度不能超过200微米,限制了它在神经生物学研究中的应用。为了克服高压快速冷冻固定技术的缺点,将其应用到神经生物学研究中,本人与该技术的发明者Studer博士合作,将器官型脑片培养技术(organotypic slice culture)和高压快速冷冻固定技术相结合,成功地研究了与学习和记忆密切有关的长时程效应(long-term potentiation,LTP)对突触的影响,结果显示与化学固定相比高压冷冻固定后细胞和组织的超微结构更加清晰完整,LTP十分钟后突触小泡的数量明显下降,突触结构明显改变。结合包埋后免疫胶体金技术我们发现高压冷冻固定可明显提高胶体金标记的阳性率和特异性。因此,高压快速冷冻电镜技术为研究突触小泡递质释放和再循环机制及相关蛋白在突触上的超微结构定位和定量等神经生物学方面的研究提供了有利条件。
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