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研究背景：脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种常见的严重的中枢神经系统损伤,常会造成损伤节段以下永久性的功能障碍,又由于其具有较高的发病率、死亡率及致残率,并会在伤后给患者、患者家庭带来巨大的经济及心理负担,所以对于其致伤机制及治疗方法的研究一直是医学科学的研究热点。脊髓损伤以致伤机制可以分为原发性脊髓损伤(primary spinal cord injury,PSCI)和继发性脊髓损伤(secondary spinal cord injury,SSCI),前者为造成脊髓损伤的原发性伤害,而后者主要由一系列生理、病理机制介导。原发性损伤包括组织结构的损伤、血供中断等,继发性损伤的病理机制目前主要有创伤性缺血理论、钙离子内流理论、自由基理论、炎症理论、凋亡理论、兴奋性氨基酸理论等。而其中哪种理论是造成继发性损伤最主要的原因,仍未达成一致.目前主要认为这些机制共同参与造成了正反馈式的继发性脊髓损伤.目前脊髓损伤的治疗主要包括以下手段：1、手术治疗；2、药物治疗；3、物理治疗；4、基因治疗；5、细胞移植治疗.其中大部分方法为实验性治疗方法，仅脊髓损伤早期的手术减压及大剂量甲基强的松龙冲击治疗的有效性被循证医学所证实.锂剂应用于临床已有100余年时间,是治疗双相性情感障碍最重要的药物.近20年,由于对其作用及机理的深入研究,特别是其对神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)和神经前体细胞(Neural Precursor Cells,NPCs)促增殖及促定向分化作用的深入研究,使人们认识到它在脊髓损伤治疗中的潜在价值。研究证实锂剂具有促进神经干细胞的增殖、抑制受损神经元的凋亡、促进神经营养因子的释放等多种保护作用,而这些作用多是通过GSK-3β通路实现的。现锂剂治疗脊髓损伤已进入了临床实验阶段,应用于脊髓损伤患者的安全性已得到评估.但是目前锂剂临床应用于脊髓损伤仍是沿用其治疗双相性情感障碍的剂量要求,要求血药浓度维持在一定的水平,即维持血药浓度于0.6-1.0mM之间.由于锂剂的药物代谢特点,为了维持相对稳定的血药浓度,往往需要每日口服两次甚至三次.而锂剂的中毒剂量与有效剂量极其接近,高于1.2mM的血药浓度便有可能造成中毒,需要严密观测血药浓度。长时间的口服还有可能引起严重的肾脏及中枢神经系统副作用。有最新的回顾性研究报道,间断给药治疗双相性情感障碍,仍会有较好的效果,而并不一定要维持相对稳定的血药浓度,这样也会有更好的依从性。本实验设计从锂剂治疗双向性情感障碍及脊髓损伤最重要的机制：促进神经干细胞增殖及定向分化入手,研究锂剂对体外培养大鼠神经干细胞增殖及分化影响的时效性,从而得出锂剂临床应用于脊髓损伤如何给药具有指导意义的数据.若短时间的给药对神经干细胞增殖与分化的作用等同于的给药,则说明单次给药可能优于维持相对稳定的血药浓度。若其效果弱于持续给药,则从侧面说明,持续给药在治疗效果上可能会优于每天的单次给药.同时为锂剂对神经干细胞调控机制的探索打下基础.
研究目的：1.建立NSCs体外培养体系,为体外实验打下基础；2.完善检测体系：以MTT法检测神经干细胞增殖情况,使用免疫组化法检测神经干细胞分化程度；3.比较锂剂不同给药时间与持续给药对体外培养大鼠神经干细胞上述指标的影响。
研究方法：从出生24小时以内大鼠乳鼠侧脑室下区组织分离神经干细胞,利用神经球悬浮培养法培养.鉴定神经干细胞特异性表达及多向分化能力.应用MTT法,测量不同时间点不同给药时间组表明细胞数量及增殖情况的OD值。以不同OD值绘制细胞生长曲线,应用t检验比较各组之间的差异。应用免疫细胞化学法,以FITC标记的GFAP及sy3标记的NF200染色分化7天的神经干细胞,分别计数各组自阳性细胞比率,用t检验比较各组之间差异。
研究结果：1)成功从大鼠乳鼠大脑侧脑室下区分离培养出神经干细胞,经免疫组化染色提示,培养出的细胞95%以上Nestin阳性。2)锂剂对NSCs增殖影响的时效性。MTT法监测细胞增殖情况显示：第1天和第2天,与0h组相比,各给药组组均无统计学差异(P>0.05).第3天,4h组、8h组及24h组与0h组相比均有统计学差异(P<0.05),4h组与24h组之前亦有统计学差异(P<0.05),而8h组与24h组之间无统计学差异(P>0.05),1h组与0h组无统计学差异(P>0.05)；第4天,4h组、8h组和24h组与0h组相比,有统计学差异(P<0.05),4h组与24h组之间有统计学差异(P<0.05),但4h组与0h组较前一天差异减小.之后三天,8h组和24h组与Oh组相比,有统计学差异(P<0.05),8h组与24h组之间无统计学差异(P>0.05),1h组和4h组与0h组之间相比无统计学差异(P>0.05).以上结果显示：与0h组相比,1h及4h组生长趋势未有明显差异,但8h及24h组有较强的增殖活性,且两组之间增殖活性无明显差异。3)锂对NSCs分化影响的时效性。经荧光细胞免疫化学监测显示：24h、8h组与0h组相比,GFAP阳性细胞比例有显著性差异(P<0.05),而4h组、1h组与oh组相比无显著性差异(P>0.05)；24h及8h组与0h组相比,NF200阳性细胞比例有显著性差异(P<0.05),而4h及1h组与0h组相比无显著性差异(P>0.05).
结论：1)使用机械分离加巴氏管吹打取代胰酶消化,同样可以完成原代神经干细胞培养时组织的分离过程,并且避免了神经干细胞与可能诱导分化的动物血清接触.2)锂剂可以明显促进神经干细胞的增殖,而神经干细胞每日接触8小时含锂培养基可以达到与24小时同样的促进神经干细胞增殖的作用。3)锂剂可以明显促进神经干细胞向神经元方向的定向分化,而神经干细胞每日接触8小时含锂分化培养基可以达到与24小时同样的促分化作用。
研究目的：1.建立NSCs体外培养体系,为体外实验打下基础；2.完善检测体系：以MTT法检测神经干细胞增殖情况,使用免疫组化法检测神经干细胞分化程度；3.比较锂剂不同给药时间与持续给药对体外培养大鼠神经干细胞上述指标的影响。
研究方法：从出生24小时以内大鼠乳鼠侧脑室下区组织分离神经干细胞,利用神经球悬浮培养法培养.鉴定神经干细胞特异性表达及多向分化能力.应用MTT法,测量不同时间点不同给药时间组表明细胞数量及增殖情况的OD值。以不同OD值绘制细胞生长曲线,应用t检验比较各组之间的差异。应用免疫细胞化学法,以FITC标记的GFAP及sy3标记的NF200染色分化7天的神经干细胞,分别计数各组自阳性细胞比率,用t检验比较各组之间差异。
研究结果：1)成功从大鼠乳鼠大脑侧脑室下区分离培养出神经干细胞,经免疫组化染色提示,培养出的细胞95%以上Nestin阳性。2)锂剂对NSCs增殖影响的时效性。MTT法监测细胞增殖情况显示：第1天和第2天,与0h组相比,各给药组组均无统计学差异(P>0.05).第3天,4h组、8h组及24h组与0h组相比均有统计学差异(P<0.05),4h组与24h组之前亦有统计学差异(P<0.05),而8h组与24h组之间无统计学差异(P>0.05),1h组与0h组无统计学差异(P>0.05)；第4天,4h组、8h组和24h组与0h组相比,有统计学差异(P<0.05),4h组与24h组之间有统计学差异(P<0.05),但4h组与0h组较前一天差异减小.之后三天,8h组和24h组与Oh组相比,有统计学差异(P<0.05),8h组与24h组之间无统计学差异(P>0.05),1h组和4h组与0h组之间相比无统计学差异(P>0.05).以上结果显示：与0h组相比,1h及4h组生长趋势未有明显差异,但8h及24h组有较强的增殖活性,且两组之间增殖活性无明显差异。3)锂对NSCs分化影响的时效性。经荧光细胞免疫化学监测显示：24h、8h组与0h组相比,GFAP阳性细胞比例有显著性差异(P<0.05),而4h组、1h组与oh组相比无显著性差异(P>0.05)；24h及8h组与0h组相比,NF200阳性细胞比例有显著性差异(P<0.05),而4h及1h组与0h组相比无显著性差异(P>0.05).
结论：1)使用机械分离加巴氏管吹打取代胰酶消化,同样可以完成原代神经干细胞培养时组织的分离过程,并且避免了神经干细胞与可能诱导分化的动物血清接触.2)锂剂可以明显促进神经干细胞的增殖,而神经干细胞每日接触8小时含锂培养基可以达到与24小时同样的促进神经干细胞增殖的作用。3)锂剂可以明显促进神经干细胞向神经元方向的定向分化,而神经干细胞每日接触8小时含锂分化培养基可以达到与24小时同样的促分化作用。