【摘 要】
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目的：在慢性牙周炎导致的牙周组织缺损再生中,功能性牙周再生的关键在于牙骨质的生成.成牙骨质细胞(CBs)在体外可以形成牙骨质基质,并且介导新生骨、牙周膜及牙槽骨的生成,达到完全意义的牙周再生.然而CBs数量极少,分离困难,因此其应用受到极大的限制.脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)具有多向分化能力,并可在体外大量扩增,且有研究证实,ADSCs可以牙向分
【机 构】
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中国人民解放军总医院口腔医学研究所
【出 处】
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北京口腔医学论坛暨2014北京口腔医学会学术年会
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目的：在慢性牙周炎导致的牙周组织缺损再生中,功能性牙周再生的关键在于牙骨质的生成.成牙骨质细胞(CBs)在体外可以形成牙骨质基质,并且介导新生骨、牙周膜及牙槽骨的生成,达到完全意义的牙周再生.然而CBs数量极少,分离困难,因此其应用受到极大的限制.脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)具有多向分化能力,并可在体外大量扩增,且有研究证实,ADSCs可以牙向分化为类成牙骨质样细胞及牙本质-牙髓复合体样结构.目前大量研究证实Wnt/β-catenin信号通路在干细胞的分化调控中发挥重要作用,然而在ADSCs的成牙骨质分化过程中β-catenin的作用机制仍不明确.目的：探索β-catenin在牙囊细胞条件培养液(Dental Follicle Cell-Conditioned Medium,DFC-CM)诱导ADSCs向成牙骨质细胞分化过程中的作用机制.方法：分培养大鼠脂肪细胞,采用免疫磁珠法获取纯化的ADSCs.分离培养大鼠的牙囊细胞,并制备DFC-CM.用DFC-CM对ADSCs诱导7天,real time PCR、Western Blot检测成牙骨质细胞关键基因、蛋白(CAP,ALP,BSP及OPN)的表达；免疫荧光检测DFC-CM诱导7天后ADSCs中Wnt经典信号通路关键蛋白β-catenin的表达,real time PCR检测Wnt经典通路下游关键转录因子LEF-1及TCF-4的表达.用含大鼠重组蛋白DKK-1(Wnt/β-catenin经典信号通路抑制剂)的DFC-CM诱导ADSCs,7天后Western Blot检测DKK-1对β-catenin及Wnt经典信号通路中游GSK3β的表达,real time PCR检测LEF-1及TCF-4的表达；免疫荧光检测对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs细胞内ACP及BSP的表达；real time PCR检测DKK-1抑制ADSCs β-catenin后CAP,ALP,BSP及d OPN基因表达,Western Blot检测BSP及CAP蛋白的表达.结果：1.DFC-CM诱导ADSCs后其成骨质分化关键基因表达显著增高,其中与对照组相比CAP增高15.1247倍、ALP增高4.0856倍、BSP增高3.3543倍、OPN增高3.1054倍(图1A). Western Blot检测结果显示CAP,ALP,BSP及OPN(图1B,C)蛋白表达水平也显著高于对照组.2.免疫荧光结果显示在对照组及DFC-CM诱导组ADSCs细胞浆与细胞核中均表达β-catenin,但是DFC-CM组β-catenin荧光表达强度低于对照组(图2A).在细胞核内β-catenin作用于LEF/TCF而启动下游靶基因的表达.Real time PCR结果显示在DFC-CM诱导条件下ADSCs的LEF-1及TCF-4基因表达水平显著低于对照组(图2B).3.对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1 100 ng/mL培养7d后ADSCs中β-catenin表达水平显著降低,其中DFC-CM+ DKK-1组蛋白降低水平最显著(图3A).DFC-CM组GSK3β蛋白水平高于对照组,当加入DKK-1后DFC-CM组GSK3β并未产生显著变化(图3A).Real time PCR结果显示对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs中LEF-1(图3B)及TCF-4(图3C)的表达水平显著降低.免疫荧光结果显示DFC-CM+DKK-1组BSP及CAP表达增强(图3D),对照组加入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP,ALP,BSP及OPN的表达无显著性差异,而DFC-CM组入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP,ALP,BSP及OPN的表达水平显著升高(图3E).结论：本研究证实ADSCs可作为牙再生的种子细胞,DFC-CM可为ADSCs的成牙骨质方向分化提供必需的微环境. β-catenin在DFC-CM诱导ADSCs成牙骨质分化中发挥关键作用,抑制β-catenin可增强DFC-CM诱导条件下ADSCs的成牙骨质分化能力.
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