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目的 X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)通过抑制caspase活性参与调节细胞凋亡。在多种恶性肿瘤组织中,XIAP表达上调,包括前列腺癌,急性和慢性白血病及其他恶性肿瘤,同时XIAP蛋白也是多种环境污染物致癌作用的重要靶分子。越来越多的研究证实,XIAP蛋白具有非细胞凋亡的生物学新功能,如参与细胞内信号转导过程。本研究将在前期研究的基础上,针对XIAP蛋白RING结构域的E3连接酶活性调节肿瘤细胞增殖的分子机制进行研究。方法利用脂质体转染法将XIAPFull Length、XIAP?RING、XIAP?BIR、XIAPH467A及pcDNA3.0空质粒转染入HCT1 16 XIAP-/-细胞,经过抗生素筛选构建稳定转染细胞株;软琼脂克隆形成实验检测不同稳定转染细胞株的克隆形成能力;ATP酶活性检测实验检测不同稳定转染细胞株的细胞增殖速度;流式细胞检测测定细胞周期分布;Western b1ot实验检测蛋白表达;RT-PCR实验检测mRNA表达;荧光素酶活性报告基因转染检测目的基因的转录活性;免疫共沉淀实验检测蛋白在细胞内的结合。结果软琼脂克隆形成实验结果显示,XIAP-/-细胞形成克隆的数量较野生型细胞明显减少;恢复XLAP表达后,克隆形成数量明显增加,但是向XIAP-/-细胞中转染XIAPH467A表达质粒后,克隆形成数量没有明显改变。ATP酶活性检测细胞增殖能力,结果与软琼脂内克隆形成实验趋势一致。流式细胞检测显示HCT116 XIAP-/-细胞处于G0/G1期的比例较野生型HCT116细胞明显增加,达到84.58%;转染了XIAP全长表达质粒后G0/G1期的比例基本恢复;但是转染了E3连接酶活性位点突变的表达质粒后G0/G1期的比例不能恢复。Western blot结果显示,XIAP E3连接酶活性能够影响细胞周期调节蛋白cyclin D1表达,对其他细胞周期调节蛋白的表达没有影响。RT-PCR实验和启动子荧光素酶活性报告基因检测证实XIAP的E3连接酶活性影响了cyclin D1基因转录。转录因子转位分析结果显示,C-Jun磷酸化和AP-1转录因子可能参与了XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1转录,荧光素酶活性报告基因检测结果显示,XIAP的E3连接酶活性可以影响AP-1转录活性,而C-Jun的显性负性突变体TAM67能够改变XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1表达。免疫共沉淀证实PP2A能够与C-Jun在细胞内结合,抑制PP2A活性能够使C-Jun磷酸化和cyclin D1表达增高。以上结果提示,XIAP的E3连接酶活性通过PP2A/C-Jun/cyclin D1通路影响肿瘤细胞G1/S期过渡和细胞增殖。结论本研究发现XIAP蛋白除了调节细胞凋亡,还可以调节细胞增殖。XIAP的E3连接酶活性影响肿瘤细胞增殖能力与调节cyclin D1表达有关;XIAP的E3连接酶活性能够抑制PP2A磷酸化,进而影响PP2A对C-Jun磷酸化的调节,从而调节cyclin D1的转录。本研究结果说明,XIAP蛋白的E3连接酶活性位点是肿瘤治疗的潜在靶标,为环境污染物致癌作用的预防和治疗提供了新的策略。