【摘 要】
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目的构建结核分枝杆菌38kD-16kD 融合蛋白的重组表达体,在大肠杆菌 BL21（DE3） 中高效表达,并对表达产物进行纯化和复性,通过鉴定其所具有的免疫原性,评价其在结核病血清学诊断方面的价值及可能的临床应用前景。方法通过聚合酶链反应（PCR）重叠扩增获得38kD-16kD 融合基因片断,以质粒 pET21a 作为表达载体,选取 EcoR Ⅰ,Xho Ⅰ 2种内切酶,通过 T4连接酶, 构建重
【出 处】
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2007年中国防痨协会全国学术会议论文集
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目的构建结核分枝杆菌38kD-16kD 融合蛋白的重组表达体,在大肠杆菌 BL21（DE3） 中高效表达,并对表达产物进行纯化和复性,通过鉴定其所具有的免疫原性,评价其在结核病血清学诊断方面的价值及可能的临床应用前景。方法通过聚合酶链反应（PCR）重叠扩增获得38kD-16kD 融合基因片断,以质粒 pET21a 作为表达载体,选取 EcoR Ⅰ,Xho Ⅰ 2种内切酶,通过 T4连接酶, 构建重组质粒 pET21a-38kD-16kD；转化处于感受状态的大肠杆菌 BL21（DE3）中,以1mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹法（Western blotting）鉴定38kD- 16kD 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和免疫原性, 同时确定重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达形式；应用 pET21a表达载体上6个连续的组氨酸标签 （His-Tag）纯化重组融合蛋白；在不断降低尿素浓度的 PBS 中,通过半透膜恢复重组融合蛋白的天然结构；Western blotting 和酶联免疫吸附实验 （ELISA）分析重组融合蛋白的免疫原性。结果成功构建重组质粒 pET21a-38kD-16kD,通过对目的基因的酶切鉴定和全基因测序表明构建基因完全正确；重组融合蛋白经 SDS-PAGE 后显示融合蛋白主要以包涵体的形式表达,分子量约为56kD, 其表达量约占细胞总蛋白量的50%；重组融合蛋白的变性包涵体经8mol/L 尿素溶解后经镍柱纯化,纯度达90%以上；通过半透膜缓慢透析后恢复了重组融合蛋白的天然结构；经 Western blot- ting 证实重组融合蛋白能与结核分枝杆菌多克隆抗体结合,ELISA 结果同样表明重组融合蛋白能与结核病患者血清发生特异性的免疫反应。结论成功表达和纯化了38kD-16kD 融合蛋白,其所具有的特异免疫原性,使38kD-16kD 重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。
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