论文部分内容阅读
目的 利用穿膜肽Tat PTD 的穿膜作用和内皮抑素(Endostatin)的抑制新生血管生成的作用,将二者通过基因工程的手段融合在一起,以期获得能够穿透眼球屏障的内皮抑素,达到通过简单的局部滴眼给药预防视网膜或脉络膜血管增生的目标.方法 选用pET28a 作为表达载体,构建含有Tat PTD-Endostatin的重组质粒,转入E.coli Rosetta(DE3)中,IPTG 诱导表达融合蛋白；采用直接稀释法对包涵体蛋白Tat PTD-Endostatin 进行复性；使用Histrap 预装柱对复性后的蛋白进行纯化；SDS-PAGE 及Western bolt 对目的蛋白进行检测；采用CCK-8 法测定Tat PTD-Endostatin 对人脐静脉内皮细胞EAHY926 增殖的抑制作用；建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,评价Tat PTD-Endostatin 对CAM 血管生成的影响；采用荧光显微镜和流式细胞术考察Tat PTD-Endostatin 的入胞能力,并对其入胞机制进行了研究；采用免疫组化法考察蛋白穿透眼球屏障的能力；通过激光烧伤法建立小鼠脉络膜新生血管(CNV)模型对Tat PTD-Endostatin 的药效学进行评价.结果 大肠杆菌表达的Tat PTD-Endostatin 的分子量为22kD,可以与6×His 抗体结合,表明目的蛋白含有6×His 标签；复性后的Tat PTD-Endostatin能显著地抑制内皮细胞的增殖,当浓度大于4μmol/L 时,抑制率大于80％；TatPTD-Endostatin 能够明显抑制bFGF 诱导的CAM血管的生成；Tat PTD-Endostatin的入胞能力要远远高于Endostatin,且其是以多种方式进入细胞的； TatPTD-Endostatin 滴眼给药后视网膜细胞层出现了目的蛋白,而Endostatin 组没有目的蛋白的分布,证明通过滴眼给药Tat PTD 能够携带Endostatin 穿透眼球屏障到达视网膜；滴眼给药Tat PTD-Endostain 组的CNV 面积明显减少,表明TatPTD-Endostatin 能够抑制CNV 血管的生成.结论 采用大肠杆菌表达复性纯化的Tat PTD-Es 具有较好的抑制内皮细胞增殖及CAM 新生血管生成的作用,入胞能力也较Es 有较大的提高,经局部滴眼给药后能够穿透眼球屏障,并能够抑制CNV新生血管的生成,达到了我们的预期目的,Tat PTD-Endostatin 在治疗眼底新生血管疾病时给药方式方便,疗效显著,是有开发前途的新型融合蛋白.