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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是在自然界植物、动物以及微生物中广泛存在的一种非蛋白质的氨基酸。GABA在控制神经递质信号中起到神经传递的主要抑制剂的作用,因此在人体中具有重要的生理功能,例如治疗头痛、脑动脉疾病,降低血压、供氧和脑代谢等。此外,GABA可用于合成2-吡咯烷酮和4-聚酰胺尼龙。基于这些优势,GABA广泛应用于食品、制药和工业生产中。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD;EC 4.1.1.15)是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶,该酶广泛存在于真核和原核生物中。GAD不可逆的催化L-谷氨酸(L-glutamate,L-Glu)或者谷氨酸钠生成GABA和二氧化碳,是生物转化谷氨酸生成GABA过程的中限速酶。尽管目前已经有了许多关于制备GABA的相关报道,但是如何简单高效率、低成本的获得高质量的GABA,却很少报道,本文的研究课题具体如下:1.重组菌株的构建。从E.coli基因组中通过PCR扩增得到GAD基因片段,克隆到载体pET-23a中,构建成重组质粒pET-23a-GAD,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中构建成重组菌株,重组菌株接种至培养基中进行摇瓶培养,经SDS-PAGE和Western-Blot检测目的基因的表达情况。2.全细胞转化L-Glu生成GABA。使用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,收集菌体进行全细胞催化反应。以更加低廉的谷氨酸钠作为前体底物,经过在饱和溶液中添加浓盐酸转变成谷氨酸,再以谷氨酸作为最终的底物,在500 mL反应体系中添加终浓度为0.5mM的PLP,无需缓冲体系,采用分批补加底物,38℃搅拌反应,经过48h反应,可以将800g谷氨酸钠近100%转化掉。3.高密度发酵。重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株以10%的比例接种与5L的发酵罐中,通过调节转速以及通气量维持生长周期内的溶氧在30%-50%,发酵结束之前的6h开始诱导,测得全细胞转化L-Glu的活性可以达到2000U/mL,较摇瓶培养的活性可以提高30倍。4.GABA的结晶纯化。待转化反应经薄层层析检测确定已经完全转化后,将反应混合物离心,收集上清,70℃旋转蒸发浓缩后加入4倍体积的无水乙醇,缓慢降温,过滤得到GABA晶体。5.GABA纯度测定。采用高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化测定GABA纯度,达到99.2%以上,为以后的大规模生产奠定基础。