氟噻唑吡乙酮(通用名称oxathiapiprolin)是美国杜邦公司2007年研发出的结构新颖的杀菌剂,其化学结构中包含了吡唑环、噻唑环和异噁唑啉环,是迄今为止生物活性最高的一类杀菌剂。国内外前期研究中,通过紫外诱导和药剂驯化的方法分别获得了辣椒疫霉和烟草疫霉对氟噻唑吡乙酮的系列抗性突变体,进一步研究发现靶标蛋白ORP1存在20种点突变类型(L733W、S768I/F/K/Y、G770A/I/P/V/L、AG818△F819、N837I/F/Y、G839W、P861H、L863W/F、I877F/Y)。笔者课题组前期通过CRISPR/Cas9定点编辑的方法明确了ORP1上G770V和G839W位点的突变与疫霉菌对氟噻唑吡乙酮的抗性相关,而目前报道的以上其他突变类型与病原菌抗药性的相关性,以及其引起的抗药性水平及对疫霉菌生物学表型的影响尚属未知。本研究以野生型大豆疫霉P6497的PsORP1为编辑靶标,分别构建PsORP1蛋白ORD结构域上除L863F之外的17种点突变的CRISPR/Cas9定点编辑同源替换载体。通过遗传转化的方法,获得系列PsORP1定点突变阳性转化子。敏感性测定结果显示,8种点突变类型(L733W、S768Y/F、N837F/Y、P861H、L863W、I817Y)均能导致大豆疫霉对氟噻唑吡乙酮的高水平抗性,抗性倍数大于2000倍,其余点突变类型引起的抗性倍数均小于200倍,推测不同突变类型所引起的药剂与靶蛋白之间结合能力的改变不同。进一步测定了不同突变类型转化子与野生型菌株在菌丝生长速率、孢子囊产量、游动孢子产量、休止孢萌发和卵孢子产量方面的差异。结果表明,不同类型转化子在菌丝生长速率、孢子囊产量、游动孢子产量方面与野生型菌株相当或低于亲本,在休止孢萌发及卵孢子产量方面与亲本无显著差异,表明不同类型的大豆疫霉抗性突变体具有与亲本相当或较低的田间生存适合度。综上所述,疫霉菌ORP1上L733W、S768Y/F、N837F/Y、P861H、L863W、I817Y的单位点突变可引起病原菌对氟噻唑吡乙酮的高水平抗性,田间生产中须针对这些潜在的突变位点进行抗性分子检测和早期预警。