目的 多项研究表明,中间丝蛋白Nestin作为细胞中重要的骨架蛋白,在细胞抵抗外界应激中发挥着重要的作用,然而其具体机制尚不清楚。本课题组已经在多种细胞中发现干扰Nestin会导致细胞内线粒体来源的活性氧改变,近期,质谱、超分辨显微镜等手段提示Nestin不仅对活性氧产生有调控作用,还可能直接调控细胞内抗氧化系统。因此,本实验通过构建稳定干扰Nestin的肺癌细胞系,检测干扰Nestin后细胞内抗氧化水平的改变,深入探讨Nestin调节细胞内环境抗氧化体系的具体分子机制,进而为我们解析中间丝蛋白的生物学功能以及在维持细胞内环境稳态中的作用提供重要依据。方法 本实验通过RNA干扰技术构建了肺癌细胞系A549和H1299的Nestin干扰株。细胞经过氧化氢处理后,我们利用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒和死活试剂盒检测细胞在干扰Nestin前后对氧化应激敏感性的关系。接着,我们利用荧光定量PCR技术、谷胱甘肽含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶活性检测试剂盒等手段检测干扰Nestin前后肺癌细胞系抗氧化体系的变化。进而,利用免疫共沉淀和免疫荧光染色来验证Nestin、Nrf2和Keap1三者间的关系。最后,使用蛋白合成抑制剂(CHX)和蛋白酶体抑制剂(MG132)等处理细胞,深入研究Nestin对Nrf2蛋白稳定性的影响及二者间的关系。结果 凋亡检测实验显示,在过氧化氢的诱导下,干扰Nestin导致肿瘤细胞死亡增多。对细胞抗氧化体系的检测结果显示,干扰Nestin导致肿瘤细胞抗氧化相关基因表达水平下降,细胞中谷胱甘肽含量减少,超氧化物歧化酶活性下降。而对抗氧化体系上游关键转录因子Nrf2的检测表明,无论在正常状态或是诱导状态下,干扰Nestin可导致肿瘤细胞中Nrf2降解增多,蛋白水平下降,且主要通过keap1介导的泛素-蛋白酶体途径降解。最后,免疫印迹、免疫荧光染色及免疫共沉淀实验显示,Nestin与Keap1存在共定位,Nestin可通过竞争性结合Keap1来上调Nrf2的蛋白水平。结论 中间丝蛋白Nestin通过与Nrf2竞争性结合Keap1,抑制Keap1对Nrf2的泛素化降解,稳定Nrf2的蛋白水平,进而上调抗氧化相关基因的表达,增强细胞的抗氧化能力。