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CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是近年来出现的一种由RNA指导的Cas9蛋白核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。这种系统的操作性更高,突变效率更高。己糖激酶(Hexokinase,HXK)是一种多功能蛋白,既能催化糖酵解,又参与植物糖感知和转导。本试验通过构建OsHXK6的CRISPR/Cas9敲除载体,导入高表达转玉米C4-PEPC基因水稻(PC)中以获得突变体。构建方法如下:1.根据NCBI上公布的水稻OsHXK6的c DNA全序列与外显子序列进行对比分析,在外显子上设计sgRNA引物,引物序列如下:Forward:5’-GGCATGTTCTATGCTCTCGATCTT-3’和Reward:5’-AAACAAGATCGAGAGCATAGAACA-3’;Forward:5’-GGCATTCAG ATTACGATAATGCCT-3’和Reward:5’-AAACAGGCATTATCGTAATCTGAA-3’。2.用BsaⅠ酶切割sgRNA(POs-sgRNA)载体的质粒,37℃过夜保存后凝胶回收酶切产物。3.将设计好的引物退火形成双链后用T4连接酶连入切割后的sgRNA载体(POssgRNA)。4.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含卡那霉素抗性的LB培养基平板上,37℃倒置培养过夜,挑取单克隆并做菌落PCR鉴定,鉴出阳性克隆提质粒并测序验证。5.阳性质粒与Cas9载体(PH-Ubi-Cas-9)经过LR反应,经含壮观霉素抗性的LB平板培养筛选以及DH5α感受态细胞转化提纯后,得到OsHXK6的CRISPR/Cas9终载体。6.利用农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的终载体转入高表达转玉米C4-PEPC基因水稻中,经抗性筛选与分化,最终获得转玉米C4-PEPC基因水稻背景的hxk6突变株M271、M272,共计60株。7.田间观察两种突变体植株均处于抽穗期:与PC水稻相比,突变株抽穗期提前,其他特征在观察中,该研究为深入揭示HXK的功能和遗传机制提供了材料基础。