论文部分内容阅读
苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是世界性分布最广的一类苹果潜隐性病毒,该病毒会导致树体衰弱、产生慢性病害,严重影响果树的生长发育。繁育无毒苗木是目前苹果病毒病害最为有效的防治措施。但ACLSV在常规品种上不表现明显症状,加之树体大、病毒含量受气候因素影响,在不同生育期病毒在树体内分布不均,影响了病毒的检测效率。因此,了解病毒在植株体内的分布规律是准确诊断的前提,也是果树无毒栽培的基本保障。本研究利用实时荧光定量RT-PCR技术,对苹果不同生长发育时期、不同组织部位ACLSV进行测定,揭示病毒分布规律,为ACLSV的准确诊断及无毒苗木生产奠定基础。取得的具体研究结果如下。(1)ACLSV实时荧光定量RT-PCR检测体系的优化:参考王鹏等(2013)的引物,对检测体系进行了优化。测定了内参基因和病毒基因引物特异性,确定病毒特异性引物最佳引物浓度为10μmol/L、最佳退火温度为57℃,优化后的检测体系灵敏度为10-6模板稀释液,并且验证了该方法在田间检测中的可靠性。(2)ACLSV在苹果植株体内的分布:采用实时荧光定量RT-PCR技术,对2015年9月中旬至2016年4月中旬苹果树体内ACLSV基因相对表达量进行了测定。从生长发育时期、树体方位和组织部位3个角度对病毒含量变化进行了分析,结果表明:①从生长发育时期角度进行分析,在苹果一年生枝条树皮组织中,以9月份ACLSV RNA表达量为参照,病毒含量的整体趋势是从9月中旬到10月中旬大幅度升高,10月中旬达到这8个月份中的最高峰,此后病毒含量开始下降,3月起呈上升趋势。②从树体方位角度分析,在苹果一年生枝条树皮组织中,以东向ACLSV RNA的表达量为参照,ACLSV在4个方位上的病毒含量差异比较显著,位于南向的病毒含量在所有采集时期中均高于其他方向,而西向与北向的差异较小且大部分时期都低于东向。③从组织部位角度分析,在苹果的盛花期,以幼叶中ACLSV RNA的表达量为参照,ACLSV在花中的含量最高,幼叶最低,ACLSV含量由高到低的顺序依次为:花、两年生枝条树皮组织、芽、一年生枝条树皮组织和幼叶。