【摘 要】
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采用高保真聚合酶从质粒pBI121中扩增出1.8 kb的专一条带,克隆入pBluescript SK载体,测序结果显示与报道一致.该克隆GUS基因被用作对照,再以此为模板,通过DNA重排技术,经DNase Ⅰ降解,Primerless PCR,Primer PCR重新得到大量的突变GUS基因.这些突变的GUS基因构建入原核表达载体pG251中,电击转化大肠杆菌菌株DH5α,构建GUS基因突变体库,
【机 构】
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上海市农业遗传育种重点实验室,上海市农业科学院生物技术研究中心 扬州大学生物科学与技术学院,扬州,
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采用高保真聚合酶从质粒pBI121中扩增出1.8 kb的专一条带,克隆入pBluescript SK载体,测序结果显示与报道一致.该克隆GUS基因被用作对照,再以此为模板,通过DNA重排技术,经DNase Ⅰ降解,Primerless PCR,Primer PCR重新得到大量的突变GUS基因.这些突变的GUS基因构建入原核表达载体pG251中,电击转化大肠杆菌菌株DH5α,构建GUS基因突变体库,经过3轮的重排、筛选得到80℃处理30 min仍显示较高活性的耐高温GUS基因GUS3-3,基因测序显示,GUS3-3与GUS基因之间的同源性为99.2％,核苷酸序列推导的氨基酸序列显示,11个氨基酸发生了突变,80％的突变集中在蛋白的C端.Tm值GUS3-3为80℃,GUS-ck为55℃,提高了25℃,GUS3-3β-葡萄糖苷酸酶热稳定性有了很大的提高,GUS3-3酶的最适温度明显提高.
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