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蝉花广泛分布于我国江浙地区及西南一带,在民间已有数千年的食用及药用历史。其生物活性广泛且资源丰富,因此合理开发利用蝉花资源具有十分深远的意义。多糖是蝉花的主要活性成分,虽然已有关于蝉花多糖理化性质及免疫调节活性研究的报道,但是仍不够系统和深入。因此,本文以从蝉花粗多糖中分离纯化得到的均一组分多糖JCH-1为研究对象,探究其基本理化性质。同时,以小鼠巨噬细胞RAW264.7为靶细胞,系统评估其免疫调节活性,并阐明其作用机制,以期为蝉花药用资源及其相关健康产品的综合开发与利用奠定基础。目的:1.测定JCH-1单糖组成及总糖、蛋白质、硫酸基与糖醛酸的含量,探究其基本理化性质。2.考察JCH-1对RAW264.7细胞形态、增殖能力、吞噬能力及免疫活性物质(NO、TNF-α及IL-6)释放量的影响,评估JCH-1免疫调节活性。3.考察JCH-1对RAW264.7细胞TLR4-MAPK-NF-KB信号通路的影响,探究JCH-1免疫调节机制。方法:1.JCH-1基本理化性研究采用糖腈酸酯衍生化法测定JCH-1的单糖组成;分别采用苯酚-浓硫酸法、考马斯亮蓝法、硫酸-咔唑法及氯化钡-明胶法测定JCH-1总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量;对样品进行紫外、红外光谱扫描与分析。2.JCH-1对RAW264.7细胞免疫调节活性研究MTT法检测JCH-1对RAW264.7细胞活性及增殖能力的影响;不同浓度JCH-1作用于RAW264.7细胞后,观察并拍照记录细胞形态变化;中性红法检测JCH-1对RAW264.7细胞吞噬能力的影响;JCH-1作用于RAW264.7细胞24 h后,取上清液,Griess试剂盒测定NO含量,ELISA试剂盒测定TNF-α及IL-6含量。3.JCH-1对RAW264.7细胞免疫调节机制研究不同浓度JCH-1作用于RAW264.7细胞后,采用RT-PCR检测iNOS、TNF-α及IL-6 mRNA的表达量;TLR4抑制剂C34、MAPK通路抑制剂SP600125、PD98059、SB203580及NF-κB通路抑制剂Bay11-7082分别预处理细胞后,予以JCH-1进行干预,取上清液,Griess试剂盒测定NO水平,ELIS A试剂盒测定TNF-α及IL-6水平;不同浓度JCH-1作用于RAW264.7细胞后,采用蛋白免疫印记法检测JCH-1对RAW264.7细胞TLR4-MAPK-NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响;采用蛋白免疫印记法检测TLR4抑制剂C34、MAPK通路抑制剂SP600125、PD98059、SB203580 及 NF-κB 通路抑制剂 Bay11-7082 对 JCH-1 激活TLR4-MAPK-NF-κB信号通路的影响。结果:1.单糖组成分析结果表明JCH-1由葡萄糖、甘露糖及半乳糖组成,其摩尔比例为1.7:1.37:1;JCH-1总糖、糖醛酸及硫酸基的含量测定结果表明,其总糖、糖醛酸及硫酸基的含量分别为90.15%、1.15%、8.65%,且未检测出蛋白质;红外及紫外光谱扫描结果与含量测定结果一致。2.MTT实验结果表明,JCH-1在5～20 μg/mL浓度范围能够呈剂量依赖关系促进RAW264.7细胞增殖;细胞形态观察结果表明,JCH-1能够激活RAW264.7细胞,使其出现体积增大、伪足伸长等现象;中性红实验结果表明,JCH-1能够提高RAW264.7细胞的吞噬能力;NO、TNF-α及IL-6含量测定结果表明,JCH-1能够提高RAW264.7细胞NO、TNF-α及IL-6的释放量。3.RT-PCR结果表明,不同浓度JCH-1干预RAW264.7细胞后,其iNOS、TNF-α及IL-6 mRNA的表达量均显著上调。4.TLR4 抑制剂 C34、MAPK 通路抑制 SP600125、PD98059、SB203580 及NF-κB Bay11-7082分别预处理细胞后,予以JCH-1进行干预,检测其NO、TNF-α及IL-6释放量。与单一 JCH-1刺激组比较,抑制剂处理组NO、TNF-α及IL-6释放量均显著下降。5.JCH-1能够促进TLR4的表达,同时,促进IκB-α蛋白的磷酸化及降解,提高P65蛋白磷酸化水平及入核能力。此外,JCH-1在不改变P38、JNK、ERK总蛋白表达量的情况下,上调其磷酸化水平。6.TLR4抑制剂C34预处理细胞后,JCH-1促进IκB-α蛋白的磷酸化及降解能力减弱,诱导P65蛋白磷酸化及入核能力下降。此外,JCH-1促进P38、JNK、ERK磷酸化的能力也受到抑制;MAPK通路抑制剂SP600125、PD98059及SB203580分别预处理细胞后,JCH-1促进IκB-α蛋白的磷酸化及降解能力减弱,诱导P65蛋白磷酸化及入核能力降低;NF-κB通路抑制Bay11-7082对JCH-1促进P38、JNK、ERK磷酸化能力无影响。结论:1.JCH-1由葡萄糖、甘露糖及半乳糖组成,其摩尔比例为1.70:1.37:1。JCH-1总糖、糖醛酸及硫酸基的含量分别为90.15%、1.15%及8.65%,不含蛋白质。2.JCH-1能够提高RAW264.7细胞增殖及吞噬能力,促进RAW264.7细胞免疫活性物质(NO、TNF-α及IL-6)的释放,从而提高机体免疫功能。3.JCH-1激活RAW264.7细胞TLR4-MAPK-NF-κB信号通路是其对RAW264.7细胞发挥免疫调节作用的机制之一。