研究背景:Toll样受体(TLR)对固有免疫及获得性免疫均具有重要的调节作用。TLR信号通路调节机制的研究对于阐明机体免疫反应产生的机理,寻找免疫调节治疗的新途径具有重要科学意义和应用价值。目前发现的TLR信号通路调控分子缺乏特异性,在应用于临床治疗时有可能产生副作用,应用前景将会受到限制。寻找具有更好特异性的调控分子并阐明其作用机制,不仅可深化对TLR信号通路特异性调控的认知,更可望为疫苗研制和药物设计提供更为理想的靶点。目的:阐明TRAM酪氨酸磷酸化在TLR活化中的作用,并明确其酪氨酸磷酸化位点,为TLR信号通路转导提出新的认识;探讨酪氨酸磷酸酶PTPN4是否参与TLR信号通路的调节,并阐明其分子机制。方法:PTPN4 siRNA抑制巨噬细胞PTPN4表达后,ELISA及RT-PCR检测LPS、poly(I:C)、PGN、R848、SeV诱导的IFN-β、TNF-α及IL-6表达情况;Western Blot检测LPS诱导的IRF3、NF-κB、MAPK及poly(I:C)、SeV诱导的IRF3磷酸化情况。报告基因检测PTPN4高表达对IFN-β、IRF3、NF-κB报告基因活化的影响。免疫共沉淀检测TRAM与PTPN4结合情况。制备特异性167位酪氨酸(Y167)磷酸化TRAM抗体,检测LPS介导的TRAM磷酸化情况。构建TRAM Y167A突变体质粒,报告基因检测其介导的IFN-β、IRF3报告基因活化隋况。Western Blot检测PTPN4干扰及高表达对TRAM酪氨酸磷酸化的影响,检测PTPN4高表达对TRAM胞质转位及TLR4和TRIF结合的影响。结果:PTPN4干扰可显著增强LPS介导的IFN-β表达,而对TNF-α和IL-6的表达没有明显影响;同时,PTPN4干扰显著增强LPS介导的IRF3磷酸化,但对MAPK及NF-κB的活化均没有明显影响。PTPN4干扰对poly(I:C)、PGN、R848及SeV诱导的IFN-β、TNF-a和IL-6表达均没有明显影响;对poly(I:C)及SeV诱导的IRF3磷酸化也没有明显影响。报告基因分析发现,PTPN4明显抑制了TRAM介导IFN-β和IRF3报告基因活化,而对TRIF、TBK1、RIG-I和MAVS介导的IFN-β和IRF3报告基因活化没有明显影响。通过TRAM蛋白序列分析,我们发现在其TIR结构域154位和167位各有一个保守的酪氨酸(Y),提示其具有潜在的发生酪氨酸磷酸化的可能。LPS可诱导TRAM Y167磷酸化。Y167A突变体失去介导IFN-β、IRF3报告基因活化能力。PTPN4干扰显著增强LPS介导的TRAM Y167磷酸化;PTPN4高表达抑制LPS介导的TRAM Y167磷酸化及TRAM胞质转位,抑制TLR4和TRIF的结合。结论:TLR4活化可诱导TRAM发生167位酪氨酸磷酸化,且在TLR4介导的TRIF信号通路中发挥重要作用;PTPN4可抑制TRAM酪氨酸磷酸化,进而抑制TLR4和TRIF结合,特异性负调TLR4介导的TRIF信号通路。