[目的]拉沙洛菌素（Lasalocid,LAS）与盐霉素（Salinomycin,SAL）均属于聚醚类离子载体抗生素,主要用作饲料添加剂促进生长。但二者安全范围窄,且在人体内有累积作用,一旦食用残留超标的动物性食品,将严重危害人体健康。本研究旨在通过制备双特异性单链抗体建立免疫检测方法来测定鸡肝脏中LAS与SAL的药物残留。[方法]本试验在LAS和SAL的杂交瘤细胞株基础上,提取总RNA后反转录合成cDNA,分别扩增VH、VL基因,通过SOE-PCR拼接并扩增完整的双特异性单链抗体（Bispecific single-chain diabody,scDb）基因,用SfiⅠ双酶切scDb基因与质粒pJB33,构建scDb-pJB33表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌中,进行IPTG诱导表达和Western-blotting鉴定后,进行大量纯化,并建立icELISA方法来评估scDb的灵敏度和特异性,最后对鸡肝脏样品进行添加回收试验。[结果]经大量可溶性表达和镍柱亲和层析纯化,成功制备3.8mg/mL有活性的scDb,对LAS和SAL的IC₅₀分别为0.7 ng/mL和0.4 ng/mL,LAS在添加水平为10μg/kg、200μg/kg、400μg/kg时和SAL在添加水平为10μg/kg、900μg/kg、1800μg/kg时的回收率均大于81.8%,变异系数小于7.3%。[结论]本研究制备的scDb灵敏度和特异性良好,建立的icELISA方法满足兽药残留检测的相关要求,可用于实际样品的检测。