慢病毒介导的稳定过表达β-catenin对间充质干细胞增殖和迁移的影响

来源 :The 14th Congress of Gastroenterology China(第十四届全国消化系病学术会议) | 被引量 : 0次 | 上传用户:qazxc123
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  目的 建立慢病毒介导的过表达β-catenin基因的间充质干细胞(MSCs)株,探讨β-catenin基因对MSCs增殖和迁移的影响.方法 利用多位点Gateway克隆技术构建慢病毒过表达载体,测序鉴定其准确性,并瞬时转染293T细胞,验证其转染效率及对β-catenin基因mRNA水平的影响.利用已构建的慢病毒载体,用293T细胞进行包装,制备靶向过表达β-eatenin的慢病毒液,感染MSCs后,经嘌呤霉素筛选获得细胞单克隆,挑取阳性克隆并传代,获得稳定过表达β-catenin基因的MSC细胞株.通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测过表达β-catenin基因对mRNA水平的影响;细胞生长曲线、MTT实验检测对细胞生长活性以及细胞增殖能力的影响;Transwell体外细胞迁移实验研究对细胞体外迁移能力的影响.结果 成功建立了靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,测序结果与序列一致;瞬时转染293T细胞后,48 h转染效率达85%.RT-PCR检测结果显示,其能显著增加β-catenin基因mRNA水平的表达.与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,成功获得过表达β-catenin的慢病毒液;感染MSCs并用嘌呤霉素进行筛选后,得到稳定过表达β-catenin的MSC细胞株.与空载体组和正常MSCS组比较,实时荧光定量PCR证实,慢病毒pLV-catenin-RFP组mRNA表达显著升高[(342.00±0.62)%比(98.00±0.33)%、(100.00±0.33)%,P值<0.05);MTT和生长曲线显示pLV-catenin-RFP组细胞倍增时间缩短[(25.03±1.57)h比(27.72±0.93)h、(32.62±2.86)h,P<0.05],增殖能力增加;细胞迁移实验显示,pLV-catenin-RFP组细胞迁移能力增加(605±26比172±12、184±17,P<0.01).结论 成功构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体.成功获得慢病毒介导的稳定过表达β-catenin基因的MSCs株.稳定过表达β-catenin基因的MSCs,显著上调β-catenin基因mRNA的表达,并使MSCs的增殖能力及细胞迁移能力显著增加.
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