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目的研究六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因并构建表达载体,导入人NK细胞表达后对烷化剂抗药性的改变,研究MGMT对NK细胞保护作用。方法从人肝组织中克隆MGMT基因后重组构建真核表达粒质pcDNA3.1/myc-hisA—MGMT并鉴定。通过脂质体法将目的基因导人体外培养的NK细胞及K562细胞。取健康人外周血用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,采用percoll不连续密度梯度离心法对NK细胞进行分离纯化,在IL-2、PHA及LCM等培养条件下进行克隆化培养并用流式细胞仪鉴定CD3、CD16、CD56等细胞表型。实验分为NK细胞组及K562细胞组。每组又分为a、b、C三个亚组,a组为转染目的基因(pcDNA3.1/myc-hisA—MGMT)组,b组为转染空载体(pcDNA3.1/myc-hisA)组,C组为对照组(正常细胞)。应用实时定量PCR及Western blot检测目的基因mRNA及蛋白水平的表达。四氮唑蓝法(MTT)检测细胞对烷化剂抗药性的改变。结果成功克隆人MGMT基因,转染NK细胞和K562细胞后,实时定量PCR检测目的基因的表达结果显示转基因组MGMT mRNA表达水平分别是转染空载体组的2倍(P<0.01)和13.4倍(P<0.01),而转染空载体的各组与对照组比较则差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示MGMT蛋白表达在转基因组中明显高于转空载体组及对照组。MTT法结果显示目的基因导入后K562稳定转染细胞和NK细胞瞬时转染细胞对烷化剂的半数抑制浓度分别比转空载体组及对照组提高到原来的7倍和2倍。结论MGMT基因导入能够增强NK细胞对烷化剂的抗药性得到不同程度的增强,从而对细胞起到保护作用。探索DNA损伤修复基因导入在肿瘤治疗方面的应用,同时为基因治疗血液系统肿瘤的临床前研究提供参考依据。