论文部分内容阅读
由于生产转基因动物的基本方法如原核注射法等普遍存在外源基因整合的低效性和随机性等问题,因而在应用中受到很大制约。利用转基因体细胞作为供体进行核移植为转基因动物的生产提供了新途径。本研究目的:采用同源重组型载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,通过体细胞核移植技术研究转基因体细胞克隆胚胎的体外发育情况。实验中采用四种表达载体:1.含新霉素抗性(Neo)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的pEGFP随机型载体(rGFP);2.基于pEGFP载体构建的包括绵羊基因组同源序列的GFP同源重组型载体(hGFP);3.基于pLoxp正负筛选载体构建的含人抗胰蛋白酶因子基因同源重组载体(mAAT)和4.含肌肉生长抑制素基因(Myostatin)敲除型(Myo)。通过电穿孔方法,分别转染绵羊胎儿成纤维细胞,经800μg/mo的G418(Geniticin),同源型载体另加0.2μmol/L的GANC(Gancyclovir)筛选2周后进行PCR鉴定,阳性细胞系作为核供体进行核移植。实验一中,选用两个绵羊胎儿成纤维细胞系FOF6和FOF11,每个细胞系分别转染rGFP和hGFP载体。不同来源的细胞系中,rGFP和hGFP供体细胞重构胚的融合率和发育率有所差异。在FOF6中,随机型和同源型供体细胞融合率、卵裂率和发育至囊胚的百分率差异显著(88.0% vs 49.3%,P<0.01;61.3% vs 53.0%;29.5% vs 6.1%,P<0.05):而在FOF11中,随机型和同源型供体细胞差异不显著(75.0%vs79.0%;55.5%vs52.0%;7.4%vs7.8%,P>0.05);在实验二中,hGFP、Myo和mAAT三种类型载体细胞克隆重构胚的融合率和卵裂率分别为70.7%、64.0%、69.5%和61.9%、67.1%、62.5%,无显著差异(P>0.05);hGFP和Myo组桑椹率差异不显著(14.3% vs 12.3%,P>0.05),而mAAT组桑椹率为6.3%,显著低于其他两组(P<0.05)。以上实验结果显示,采用整合同源重组型载体的体细胞进行核移植产生克隆胚胎是可行的;此外,细胞系来源和外源基因型对克隆胚胎生产效率的影响尚需进一步深入研究。