【摘 要】
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玉米赤霉烯酮( Zearalenone,ZEN),是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构,因ZEN与雌二醇结构相似,又称F-2毒素,是由镰刀菌属在次级代谢过程中产生的一种较强的雌激素类毒素,在人和动物体内积累可诱发一系列雌激素效应症状,包括影响雌性哺乳动物乳房发育、外阴阴道炎、发情周期紊乱、假孕不孕、流产、死胎畸胎等.有报道,中国饲料中 ZEN 阳性检出率和污染水平呈逐年增高,2012 年上半年,在检测4
【机 构】
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暨南大学微生物技术研究所,广州 510632 暨南大学微生物技术研究所,广州 510632;暨南大
【出 处】
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2013年霉菌毒素与饲料安全饲料毒理学术报告会暨饲料毒理学专业委员会第五届全国代表大会
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玉米赤霉烯酮( Zearalenone,ZEN),是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构,因ZEN与雌二醇结构相似,又称F-2毒素,是由镰刀菌属在次级代谢过程中产生的一种较强的雌激素类毒素,在人和动物体内积累可诱发一系列雌激素效应症状,包括影响雌性哺乳动物乳房发育、外阴阴道炎、发情周期紊乱、假孕不孕、流产、死胎畸胎等.有报道,中国饲料中 ZEN 阳性检出率和污染水平呈逐年增高,2012 年上半年,在检测421份来自全国各地的玉米、猪料、禽料等中ZEN的阳性检出率均高于60 ％,最高浓度均高于2300 μg/kg,平均水平也均远远大于中国《粮食卫生标准》(GB2715-2005)规定的小麦和玉米中ZEN的限量(60 μg/kg).随着高效率、高效益农业集约化养殖发展蓬勃,饲料质量安全是整个养殖和产品质量安全的起点.目前,应用于实际生产中的防ZEN污染传统的物理法和化学法在降解ZEN过程中,具有降解不彻底、营养成分损失以及难以规模化等缺点,相比而言,生物降解法更具发展前景,将成为一种安全、专一、高效的解毒方法.本研究通过设计添加玉米赤霉烯酮毒素类似物(PL)的固体分离培养基,从潮州、肇庆等地采集的老面、腐乳等共计25 种发酵食品材料中经过两轮富集筛选,初步筛选出对玉米赤霉烯酮有分解作用的微生物菌株；设计薄层色谱法(TLC)对初筛得到的菌株进行确证分离及ZEN分解效率的半定量检测获得分家效率较高的阳性菌株；通过高效液相色谱法(HPLC)评价阳性微生物菌株对玉米赤霉烯酮的分解效率,并通过形态学、分子生物学方法进行菌种鉴定,确定菌株的系统分类学地位.结果：毒素类似物PL(50 mg/L)第一轮富集筛选,共计从25种发酵食品材料中筛选出175个生长良好的毒素类似物耐受菌株,加大PL浓度(10 g/L),对照不含PL培养基菌株培养浑浊度,得到69个毒素类似物耐受菌株.将初筛获得的69种菌株接种到含ZEN(10μg/mL)的液体培养基中共培养后,TLC检测各培养物中ZEN的残留,在365 nm紫外光下观察黄绿色荧光情况,以点样10μL荧光点消失作为判定是否对ZEN有分解能力的标准,结果得到10个对玉米赤霉烯酮具有分解能力的菌株,加大ZEN的浓度(20 ng/μL),第二次TLC检测,结果出现PL-M-19不生长,根据观察荧光亮度强弱确定其余9个菌株对玉米赤霉烯酮降解能力的相对大小：PL-B-35 ≈BF-B-35＞BF-B-30＞PL-B-38＞BF-B-3 ≈BF-B-9 PL-B-66＞BF-B-34 ≈PL-M-29＞PL-M-19.选取分解能力最强的三个菌种PL-B-35、BF-B-35、BF-B-30,建立HPLC模型对ZEN分解菌株的毒素降解效率评价,ZEN保留时间为9.54min,根据ZEN标准品浓度与峰面积关系制作标准曲线,ZEN在0.5～25 ng/μL浓度范围内线性良好,线性方程为：y=502219x-86763,R2=0.9931,根据ZEN标准曲线方程,测得空白对照的ZEN浓度为17.99±0.02ng/μL,本方法的回收率为：89.89 ％(回收率=空白对照/标准品×100％).对分解能力最强的三个菌种BF-B-30、BF-B-35和PL-B-35培养物ZEN残留分析,结果得到他们对ZEN分解率[实验组/(标准品-空白对照)×100％]分别为86.40％,58.05％和45.80％.最后,通过形态学观察菌落及菌体形态,通过提取上述菌种基因组DNA,利用16SrRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增、测序,测序结果与NCBI中的GenBank数据库分析比对16SrRNA序列的同源性,确定PL-B-35、BF-B-35、BF-B-30、PL-B-38、BF-B-3、BF-B-9的系统分类学地位.
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