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目的:本课题旨在揭示套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)中所涉及的表观遗传学调节异常,为进一步深入认识MCL的发病机制提供新的思路。利用临床石蜡标本作为研究对象,初步分析EZH2和EZH1在MCL中的表达及意义,为肿瘤患者的预后判断提供新的分子标记。应用特异性小分子抑制剂UNC1999作为分子工具,探索EZH2和EZH1在MCL细胞系的作用及分子机制,为临床治疗找寻新的靶点。依靠CRISPR/Cas9系统作为技术平台,从分子层面剖析EZH2和EZH1在MCL中的功能,使转化医学的发展能够取得新的突破。方法:回顾性分析临床随访资料完整的MCL石蜡标本,采用免疫组织化学染色方法检测EZH2和EZH1蛋白的表达水平,并应用统计学软件分析二者表达水平与患者总生存期之间的相关性。应用RT-q PCR和免疫印迹方法检测MCL细胞系中EZH2和EZH1的m RNA及蛋白表达水平,并通过基因检测方法研究EZH2基因是否发生突变,筛选出EZH2功能活性较高的细胞系。应用特异性小分子抑制剂UNC1999处理MCL细胞系,观察细胞增殖、凋亡及周期分布的变化,并利用信使RNA测序技术联合染色质免疫共沉淀实验深入探索其中的分子机制。依靠CRISPR/Cas9系统,构建EZH2和EZH1基因敲除的MCL细胞系,经q PCR和免疫印迹方法验证后,观察对细胞增殖及周期分布的影响,再次利用信使RNA测序技术,分析差异表达基因及其中可能存在的分子机制。结果:第一部分:EZH2和EZH1的表达影响原发性MCL患者的总生存期,且二者在MCL细胞系和幼稚B淋巴细胞中的表达水平不同。1、原发性MCL中EZH2和EZH1蛋白的阳性表达率分别为48.78%(20/41)和17.07%(7/41),与患者的临床特征无相关性。与淋巴结反应性增生相比,EZH2的阳性表达率显著升高。2、原发性MCL中EZH2的阳性表达与否能够用于判断患者总生存期的长短。而EZH1的阳性表达与否却不能。3、幼稚B淋巴细胞中EZH1的表达水平较高,而MCL细胞系中EZH2具有较高的表达水平,并伴随部分MCL细胞系中H3K27me3水平的显著升高。第二部分:UNC1999通过重新激活CDKN1C和TP53INP1基因来诱导MCL细胞系的增殖抑制及周期阻滞。1、UNC1999显著抑制MCL细胞系的增殖,且对于H3K27me3水平较高的MCL细胞系较敏感,肿瘤细胞的增殖抑制与H3K27me3水平的逐渐降低呈正比。2、UNC1999诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,且G0/G1期肿瘤细胞数目的增加与H3K27me3水平的逐渐降低呈反比;但UNC1999对细胞凋亡无明显影响。3、UNC1999可能通过降低CDKN1C和TP53INP1基因启动子区H3K27me3水平,重新激活二者的表达,继而发挥诱导细胞周期阻滞的作用。第三部分:EZH2和EZH1能够分别调节不同的细胞周期相关基因,从而对不同细胞周期阶段发挥调节作用。1、成功构建靶向EZH2和EZH1基因的Lenti-CRISPR-V2重组质粒,并感染Z138细胞,筛选获得KO-EZH2和KO-EZH1细胞。在KO-EZH2细胞中,H3K27me3水平明显降低,EZH1表达水平出现显著升高;在KO-EZH1细胞中,H3K27me3水平略有降低,EZH2表达水平未见明显改变。2、KO-EZH2细胞经过一定时间培养后即可再次呈指数生长,且大多数细胞都处于G2/M期。KO-EZH1细胞表现出的细胞增殖抑制及细胞周期分布与UNC1999的效果类似,且大多数细胞都处于G0/G1期。3、RNA-seq结果发现,与EZH2基因相比,敲除EZH1基因能够引起Z138细胞内发生更广泛的基因转录本改变。EZH2和EZH1能够分别调节不同的细胞周期相关基因,从而发挥对不同细胞周期阶段的调节作用。结论:1、EZH2和EZH1在B淋巴细胞正常发育过程中及MCL形成过程中发挥不同的功能,EZH2能够作为判断原发性MCL患者预后的分子标记之一。2、UNC1999同时抑制EZH2和EZH1的甲基转移酶活性,并通过细胞周期G0/G1期阻滞功能而显著抑制MCL细胞系的增殖,UNC1999能够作为研究MCL发病机制的有力分子工具,获得更为广泛的应用。3、EZH2和EZH1可能通过调节不同的细胞周期相关分子共同促进了MCL的发生。