【摘 要】
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目的 构建HBx 基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究 HBx 缺失对HBV复制和转录的影响.方法 以包含HBV 全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0 为模板,用定点突变技术构建HBx 基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA 测序鉴定.用SapI 单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx 缺失突变型HBV 基因组,经转染试剂PolyJet？ Reagent
【机 构】
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400010 重庆,重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010 重庆,重庆医科大学病毒性肝炎研
【出 处】
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2012南方消化论坛暨第八届全国肠道疾病学术大会
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目的 构建HBx 基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究 HBx 缺失对HBV复制和转录的影响.方法 以包含HBV 全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0 为模板,用定点突变技术构建HBx 基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA 测序鉴定.用SapI 单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx 缺失突变型HBV 基因组,经转染试剂PolyJet？ Reagent 介导分别瞬时转染到HepG2 细胞中.在转染后各时间点Western blot检测HBx 蛋白的表达,Southern blots 和real-time PCR 同时检测胞浆DNA 复制和胞核cccDNA 的合成,real-time PCR 定量HBV 前基因组RNA( pgRNA)的转录.结果 在野生组中可检测到HBx 蛋白的表达,而在HBx 突变组中HBx 蛋白的表达低于Western blot 的检测范围.两组中各时间点合成的cccDNA 水平无统计学差异(p ＞0.05).而在转染后96 小时HBx 突变组中胞浆DNA 的复制和 pgRNA 的转录都分别比野生组减少50％-70％ (p＜0.05).结论 HBx 缺失虽然不影响胞核HBV cccDNA 的合成,但是它能下调胞浆HBV DNA的复制和 pgRNA 的转录.
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