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目的：观察不同浓度(0ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml)的乳铁蛋白(Lactoferrin LF)对大鼠的成骨细胞凋亡的影响.方法：1、原代SD大鼠成骨细胞的培养及鉴定：无菌条件下取新生24h内SD大鼠的颅盖骨,采用混合酶消化法培养、差速贴壁纯化成骨细胞,通过细胞形态学观察、碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原免疫组化法(SABC法)对细胞进行鉴定.用0.25％的胰酶消化对成骨细胞进行传代培养.2、Annexin V-FITC和PI染色,流式细胞术检测成骨细胞凋亡：用第3代大鼠成骨细胞以3×105/ml细胞密度接种于25cm2培养瓶中,实验分为对照组(0ug/ml)、LF1(0.1ug/ml)组、LF2(1ug/ml)组、LF3(10ug/ml)组、LF4(100ug/ml)组、LF5(1000ug/ml)组.24小时后换含无血清的DMEM培养液24小时.不同浓度的LF干预1天后,胰酶消化并收集细胞至离心管中,1000r/min,离心10分钟,PBS洗2次后,用结合缓冲液重悬细胞,调整细胞浓度为1×106/mL,取500 μL细胞悬液至流式管中,分别加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI,混匀后于室温避光反应10min,用流式细胞仪检测成骨细胞凋亡.3、统计学方法：各实验数据采用(x)±s表示,应用SPSS11.5统计软件进行统计分析,各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA).P＜0.05,表示差异有统计学意义,p＜0.01,表示差异有显著统计学意义.结果：1、用混合酶消化法培养、差速贴壁的方法可以得到纯化的成骨细胞(1)镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足；(2)碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.2、流式细胞术(FCM)定量分析各实验组的细胞总凋亡率总凋亡率的测定：正常的活细胞不被Annexin V-FITC和PI染色；早期凋亡的细胞仅被Annexin V-FITC染色,PI染色呈阴性；晚期凋亡及早期坏死的细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色.获取细胞后由CellQuest Pro软件分析,得出总凋亡率.LF1、LF2、LF3、LF4组、LF5组与对照组相比,均有统计学意义(P＜0.01).各组总凋亡率较对照组分别降低13.6％,18.6％,70.8％,57.7％(均为P＜0.01),而LF5组的总凋亡率较对照组升高了31％.在乳铁蛋白干预1天后,LF1、LF2、LF3、LF4组均发挥抑制凋亡作用,其总凋亡率均较对照组减少.LF3、LF4抑制凋亡作用最显著,可抑制24h血清剥夺后50％以上的成骨细胞的凋亡.0.1 ug/ml、l ug/ml、10 ug/ml,100 ug/ml随着浓度的递增,LF抑制凋亡的作用也逐渐增强,其抑制凋亡作用呈浓度依赖性.但LF在10ug/ml、100 ug/ml两个浓度比较下,100 ug/ml其抑制凋亡作用的开始下降,LF在1000 ug/ml甚至出现了促凋亡的作用.故每组细胞设3个平行孔,实验重复3次.结论：LF对成骨细胞凋亡的影响有两面性,在一定的浓度范围内,LF随着浓度的递增,其抑制凋亡的作用也增强.而大剂量的LF可能对细胞存在毒性,发挥着促进细胞凋亡的作用.