大量的流行病学调查研究表明,大气细颗粒物(Particulate Matter 2.5,PM2.5)与人群心肺疾病的发病率和死亡率密切相关,其中对老年人、婴幼儿及患有基础慢性疾病等高危人群的影响尤其显著。由于流行病学研究并不能解析大气PM2.5颗粒物对人体健康造成影响的真正原因,因此在体外或体内进行大气PM2.5颗粒物毒理作用研究是解析大气PM2.5颗粒物致病机制的重要手段。大气PM2.5颗粒物由于粒径较小,在呼吸作用下可以深入肺泡内部,而后在肺泡内通过呼吸换气作用,可以进入肺脏毛细血管,并进而进入循环系统,从而对机体,尤其呼吸系统和心血管产生不利影响。本研究一方面采用两种典型的细胞系,即人肺上皮A549细胞和大鼠心肌H9C2细胞为细胞毒性评价模型,进行体外大气PM2.5颗粒物及其不同组分的毒理研究;另一方面以国际通用的Balb/c小鼠为动物毒性评价模型,采用气管气溶胶攻毒的方式进行体内大气PM2.5相关颗粒物的毒理研究。目的1.制备大气PM2.5颗粒物不同组分样本并对其化学和生物成分测定以为进一步进行生物毒理研究奠定基础。2.在体外攻毒模型中探讨北京城区大气PM2.5及其不同组分对A549细胞和H9C2细胞的毒性作用及其剂量-反应关系。3.在体内攻毒模型中探讨北京城区大气PM2.5及其单纯固体组分以气管气溶胶攻毒方式攻毒后对小鼠的急性毒性作用及其剂量-反应关系。内容与方法在北京城区设置采样点采集大气PM2.5颗粒物,进而制备得到PM2.5完全颗粒物、PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物,对各样本中8种水溶性离子、16种“酸提”元素、10种“水提”元素及16种多环芳烃的含量进行分析;同时对各样品内毒素含量进行测定,对细菌、真菌基因组拷贝数定量。用扫描电镜观察PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物的形态表征,并将PM2.5完全颗粒物、PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物以不同浓度(10、50、100、200、400μg/m L)对A549细胞染毒,用MTS法分别在染毒6h、10h、24h、48h、72h后测定细胞活力,染毒24h后测定胞内外LD含量、LDH和SOD活力,用ELISA及RT-QPCR法测定炎性因子IL-6和TNF-α表达量,AP位点计数法测定细胞DNA损伤情况。将四种PM2.5不同组分样本对H9C2细胞染毒,测定的各指标及测定方法同A549细胞,其中用MTS法测定细胞活力时所用染毒剂量同A549细胞相同,而测定其他指标时所用染毒剂量仅有溶剂对照组和10μg/m L染毒组。将PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物以气溶胶形式通过气管对小鼠攻毒,攻毒24h后摘眼珠取血处死小鼠,留存部分全血后分离血清、制备肺灌洗液及固定心脏、肝脏、肺脏,然后对各脏器做病理切片观察,并测定全血血常规、测定血清和肺灌洗液中相关生化指标和炎性因子、测定肺组织匀浆中相关炎性因子及氧化损伤相关指标。结果8种水溶性离子总质量占PM2.5各样本的质量分数依次为67.71%,0.91%,33.37%,0.09%(依次为PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分、PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物,下述数据也按此顺序描述);16种“酸提”元素总质量占PM2.5各样本的质量分数依次为4.84%,2.29%,1.86%,0.78%;16种多环芳烃总质量占PM2.5各样本的质量分数依次为0.218?,49.125?,0.403?,0.007?;单位质量(mg)各样本中内毒素含量分别为:0.0547EU,0.0184EU,0.4333EU,0.0419EU;单位质量(g)PM2.5完全颗粒物中细菌、真菌基因组拷贝量分别为:(2.572±0.954)×108,(4.269±0.916)×108。对A549细胞染毒结果显示,除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本高浓度染毒时始终对细胞生长表现出抑制作用,其中低浓度染毒时可在较短时间对细胞生长表现出抑制作用,染毒时间较长时抑制作用减弱或消失,PM2.5水溶性组分对A549细胞生长抑制作用并不显著;所有的染毒样本都造成了胞内LD含量、LDH和SOD活力及上清中LDH活力的升高,由于高浓度染毒时细胞死亡较多,因而上清中LD浓度和SOD活力变化趋势并不十分成规律性,在最高染毒浓度时多有所下降;除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了IL-6 m RNA的相对表达量和IL-6蛋白的分泌,除PM2.5脂溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了TNF-αm RNA的相对表达量;除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都显著增加了DNA碱基缺失程度。对H9C2细胞染毒结果显示,PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物在较低染毒浓度(50μg/m L)和较短染毒时间(24h以内)即对H9C2细胞生长表现出了极大的抑制作用,甚至导致细胞全部死亡,除PM2.5脂溶性组分最高染毒浓度(400μg/m L)外,PM2.5水溶性组分和PM2.5脂溶性组分对细胞生长的抑制作用极弱,甚至不表现出抑制作用;各组分样本染毒后胞内LDH活力和SOD活力都有所下降;细胞培养上清中并未检测到IL-6和TNF-α的存在,PM2.5完全颗粒物染毒后可检测到胞内TNF-αm RNA的相对表达量升高,而PM2.5脂溶性组分染毒后可检测到胞内IL-6 m RNA和TNF-αm RNA相对表达量的升高;但各组分样本染毒后未检测到DNA碱基缺失。体内攻毒结果显示,在整体水平,PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物攻毒24h后攻毒组小鼠全血中间细胞百分比略有升高;攻毒组小鼠血清中GLOB和PM2.5完全颗粒物高剂量攻毒组对应的血清中TP含量有所升高;攻毒组小鼠血清中IL-6和PM2.5完全颗粒物高剂量攻毒组对应的血清中IL-1α、CRP含量有所升高。在器官水平,攻毒组小鼠肝脏未见显著异常;PM2.5完全颗粒物攻毒组小鼠心脏可见有轻微炎症;攻毒组小鼠肺脏可见明显的炎性细胞浸润;攻毒组小鼠肺灌洗液中AST和LDH活力可检测到显著升高;攻毒组小鼠肺灌洗液中Eotaxin、IL-1β、IL-6、LIF、MCP-1、MIP-1α、MIP-2、VEGF、TNF-α、IL-8和CRP的含量能检测到显著性升高,攻毒组小鼠肺组织匀浆中IL-1α、IL-1β、IL-6、LIF、MCP-1、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的含量能检测到显著性升高,其中PM2.5单纯颗粒物低剂量攻毒组对应的小鼠肺灌洗液中某些炎症指标高于同浓度的PM2.5完全颗粒物,如Eotaxin、MCP-1、MIP-1α、MIP-2和IL-8等;攻毒组小鼠肺组织匀浆中SOD活力有所下降。结论本研究中关于PM2.5完全颗粒物、PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物的制备方法正确,达到了预期实验目的。对A549细胞染毒实验结果表明,PM2.5水溶性组分在抑制细胞活力、造成炎性损伤及DNA损伤方面作用相对较小,PM2.5单纯颗粒物在各方面所产生的毒性作用都非常显著;对H9C2细胞染毒实验结果表明,不可溶的颗粒物样本,即PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物对细胞生长的抑制作用极其显著。体内攻毒实验结果表明,在造成全身性炎症方面,PM2.5完全颗粒物比PM2.5单纯颗粒物有更强的毒性作用,而在造成肺脏局部炎症方面,PM2.5单纯颗粒物比PM2.5完全颗粒物有更强的毒性作用。总的来说,PM2.5所产生的毒性作用并不仅限于其所吸附的复杂成分,其中作为载体的固体核心颗粒对机体可能造成的毒性作用不容忽视。