人参锈腐病生防菌哈茨木霉Tri41固体发酵条件研究

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人参(Panax ginseng C.A.May)为五加科多年生药用植物,是我国传统名贵中药材。人参锈腐病是我国人参产业最重要的土传根部病害之一,严重影响人参的产量和品质。目前生产上防治人参锈腐病主要依赖化学农药,极易造成人参产品及参床农药残留超标。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是多种植物病原菌的生防拮抗菌,作用机制包括营养和空间竞争作用、重寄生作用、抗生作用和溶菌作用,其分生孢子制成的产品在防治植物白绢病、立枯病、疫病等土传病害上被认为是最有希望的生物农药,而且木霉菌拌种或土施可诱导植物抗病性并促进生长。固态发酵由于其特有的经济实用性、易于保存和运输,已经引起了人们的广泛重视。哈茨木霉Tri41为沈阳农业大学药用植物病害研究室从人参根际土壤中筛选获得,其对人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)有较强的抑制作用。本研究将培养好的哈茨木霉Tri41用无菌水配制成孢子悬浮液(1×105 cfu/mL),将孢悬液接种到培养基中,取0.5g培养物,0.1%吐温水稀释,在磁力搅拌器上充分搅匀,血球计数板测定孢子浓度;培养基采用4种混合物质培养基:玉米粉+稻壳、玉米粉+麦麸、稻壳+麦麸、玉米粉+稻壳+麦麸,混合培养基中不同物质等比例混合,根据产孢量筛选最佳培养基,并在此基础上筛选培养基中不同成分的最佳配比;在已筛选出的培养基中分别添加不同含量的水和0.2g的CuSO4、N2SO4、K2O4、MgSO4、FeSO4、CaSO4、ZnSO4,在单因素试验基础上,进行3因素多水平正交试验;优化养基后,分别向250mL三角瓶中添加10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g优化培养基;分别向25g优化培养基中接种1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL孢悬液;设定不同处理温度及变温25℃-20℃-28℃(每2天变换温度),每天测定产孢量,确定达到最大产孢量的培养时间。试验结果采用Excel软件(2003版)进行数据处理,采用SPSS11.5中的单因素方差分析(One-way ANOVA)结合LSD法对统计结果进行单因素显著性方差分析。试验结果表明,当稻壳与玉米粉配比为5:5、6:4和7:3时,哈茨木霉Tri41的产孢量最大,且差异不显著;当初始加水量为5mL、6mL、7mL时,哈茨木霉Tri41的产孢量达到最大,且差异不显著;Ca2+能过促进哈茨木霉Tri41的生长和产孢;经统计分析,组合6(玉米粉:稻壳=6:4,CaSO4含量0.3g,加水量5mL)产孢量最大;哈茨木霉Tri41在250mL三角瓶中的最适装瓶量为25g固体培养基;当接种量为7mL时,哈茨木霉Tri41产孢量达到最大;25℃条件下,哈茨木霉Tri41产孢量达到最大;随着发酵时间延长,哈茨木霉Tri41的产孢量符合逻辑斯蒂增长模型,在第8天达到最大值,培养基转为深绿色,812天为饱和期,孢子量基本保持不变。通过单因子和正交试验得到哈茨木霉Tri41固体发酵最佳培养基和最适发酵条件:250mL三角瓶中装入25g固体培养基,其中,玉米粉与稻壳按6:4混合,CaSO4含量0.375g,水6.25mL,接种量7mL,25℃培养8天。哈茨木霉Tri41对人参锈腐病菌有较好的抑制效果,本研究使用廉价的农副产品及其副产物为主料,并辅以微量矿质元素作为发酵培养基,通过单因子和正交试验对哈茨木霉Tri41固体发酵条件和培养基组分进行了优化,研究结果为下一步产业化生产和生防菌剂的研发提供理论参考,同时为人参锈腐病田间生物防治奠定了科学依据。
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