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目的：通过研究microRNA(miRNA)在成人急性髓性白血病(AML)中的表达,筛选出参与AML TRAIL耐药的miRNA分子,进一步探讨miRNA在AML TRAIL耐药中的作用及机制,为逆转AML TRAIL耐药提供新的靶点.
方法：应用MTT法检测多株AML细胞株对TRAIL的敏感性差异;qRT-PCR法筛选出在AML TRAIL敏感及耐药细胞株中的差异表达的miRNA分子;改变miRNA表达,观测AML TRAIL耐药细胞株对TRAIL敏感性的变化;应用生物信息学手段预测候选miRNA分子可能调控的下游靶基因,构建双荧光素酶报告质粒验证miRNA下游靶基因,Western Blot验证miRNA可下调靶基因在蛋白水平表达;应用小干扰RNA下调靶基因的表达后,检测AML TRAIL耐药细胞株对TRAIL敏感性的变化;Western Blot检测改变miRNA及靶基因表达水平后,TRAIL信号通路关键分子的表达变化,探讨miRNA通过靶基因影响TRAIL耐药的分子机制.
结果：在Jurkat,K562,K562/A02,HL-60,HL-60/ADM,NB4等6株急性白血病细胞株中，K562,HL-60,NB4的TRAIL耐药性最强，选择这三株AML细胞作为研究对象;分别与其阿霉素耐药株相比，K562和HL-60细胞的miR-424及miR-27a表达水平均显著下调(p<0.O1);应用miRNAmimic分别上调miR-424和miR-27a在TRAIL耐药细胞株中的表达水平后，明显增强了耐药细胞株对TRAIL的敏感性(p<0.01)及TRAIL诱导的细胞凋亡(p<0.05);生物信息学手段预测原癌基因PLAG1为miR-424和miR-27a分子的共同靶基因，分别上调miR-424和miR-27a表达水平后，PLAG1表达明显降低;荧光素酶实验证实PLAG1为miR-424和miR-27a的共同下游靶基因;应用小干扰RNA下调PLAG1在TRAIL耐药细胞株中的表达水平后，明显增强了耐药细胞株对TRAIL的敏感性(p<0.O1)及TRAIL诱导的细胞凋亡(p<0.05);分别上调miR-424, miR-27a或下调PLAG1的表达水平后，Bcl-2的表达水平均较对照显著下调，提示miR-424和miR-27a下调PLAG1发挥增强TRAIL药物敏感性的作用可能有部分是通过下调Bcl-2的表达来实现的，pro-Caspase3的表达水平无明显变化，但cleaved Caspase3水平显著增加，提示细胞凋亡增强;用200ng/ml的TRAIL处理转染后的细胞3h，与未处理的转染细胞相比，cleaved PARP及cleaved Caspase8表达显著上调，而转染了miR-424 mimic,miR-27a mimic或siPLAGl的AML细胞较其对照相比cleaved PARP及cleaved Caspase8表达上调更为显著，提示分别上调miR-424,miR-27a或下调PLAG1均增强了TRAIL诱导的凋亡过程。
结论：本项研究证实miR-424和miR-27a可能通过直接调节它们共同的下游靶基因PLAG1表达水平在AML TRAIL耐药中起重要作用，而这一作用的发挥可能有部分是通过下调PLAG1的下游靶分子Bcl-2实现的，miR-424和miR-27a有望成为逆转AML TRAIL耐药新的靶点。