帕金森病(Parkinson’s disease,PD)最早是由James Parkinson 于1817首次发现的,目前是继阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)之后第二常见的神经退行性疾病。在全球范围内约有0.2%的人患有PD,并且随着年龄的增长PD的患病率也相继增加,在85岁以上的人群中PD的患病率超过4%。2013年美国国立PD基金会统计,全世界有400万～600万名患者。PD在工业化国家中流行度约接近总人口的0.3%。PD的临床表现分为运动方面及非运动方面,在运动方面PD患者表现为静止性震颤、躯体僵直、运动机能的减退及姿态不稳等;在非运动方面PD患者主要变现为认知能力的减弱,精神障碍及嗅觉和睡眠的紊乱。导致这些临床症状的原因可能主要是脑干儿茶酚胺类特别是中脑黑质致密部(SNc)多巴胺(DA)神经元大量死亡所引起的。在PD的治疗方面主要是采取补偿性的治疗策略,但并不能完全阻止疾病的进程。因此,研究PD发病的分子基础将为发展有效的治疗策略提供科学依据。星形胶质细胞,少突胶质细胞及小胶质细胞一直以来被认为是结构性的细胞,其主要的作用是固定神经元的空间位置。然而,近些年的研究表明,星形胶质细胞具有类似于管家的功能,包括:维持细胞外的环境,稳定细胞与细胞之间的通讯。星形胶质细胞在调控大脑血流、维持突出功能、维护细胞间隙神经递质的水平稳定神经元微环境方面的作用越来越受到关注。基于这些功能星形胶质细胞在神经退行性疾病发生发展中的作用也不言而喻。针对星形胶质细胞的机制研究及功能分析将成为药物开发及治疗的潜在靶点。本课题组长期围绕JWA基因的功能在肿瘤、神经领域中开展研究,前期结果表明,JWA能够在体外模型中影响神经元对谷氨酸的摄取;JWA活跃的参与到对ERK及NF-κB信号通路的调控。在前期构建的神经系统JWA敲除小鼠模型中,我们观察到JWA剔除影响的基因主要富集于核糖体、氧化应激和氧化磷酸化及神经退行性疾病相关信号通路,以上的研究结果提示JWA在神经系统中发挥重要作用。目的:探讨在环境毒物及PD模型毒物刺激下,星形胶质细胞JWA调节多巴胺能神经元的机制。方法:将LoxP位点插入到JWA基因第2外显子两端,并与星形胶质细胞特异性表达Cre重组酶(GFAP-Cre)的小鼠进行杂交,获得星形胶质细胞JWA基因剔除小鼠。建立MPTP/p慢性中毒模型,皮下注射MPTP(20 mg/kg),腹腔注射丙磺舒(250 mg/kg)每周注射2次,间隔3.5天,共给药5周。对PD行为学、单胺类递质、神经元数目及相关蛋白含量进行检测,分析JWA在PD病理过程中的作用;为了进一步探索星形胶质细胞JWA影响神经元的机制,在体内及体外模型中通过免疫印迹、免疫荧光、荧光定量PCR等方法检测JWA对谷氨酸转运蛋白的影响,并深入探讨调控机制,同时在原代星形胶质细胞中进行验证;通过条件性上清实验明确星形胶质细胞JWA对神经元的影响;用环境毒物百草枯构建中枢神经系统损伤模型,腹腔注射百草枯(7 mg/kg),每次注射间隔48h,共注射10次,再次验证星形胶质细胞JWA缺失对环境毒物的敏感性;最后,探讨JWA对星形胶质细胞抵抗氧化应激能力的影响。结果:1.采用C57BL/6小鼠建立慢性的MPTP/p模型。对比生理盐水组模型组小鼠中脑的TH阳性细胞数下降46%,这一结果表明模型建立成功;慢性PD模型小鼠中脑JWA蛋白表达水平显著低于对照组小鼠,与对照组相比降低42%。2.星形胶质细胞JWA基因缺失(JWA CKO)显著抑制纹状体中多巴胺及其代谢产物的含量,并且在MPTP/p诱导模型中JWA CKO组DA及二羟基苯丙氨酸(DOPAC)的含量与野生型(JWA WT)比分别下降46%和41%;然而,星形胶质细胞JWA基因缺失对多种氨基酸的释放水平并无显著影响;JWA基因缺失在基础状态下对小鼠的行为学并没有显著的影响,但是在MPTP/p刺激下JWA基因缺失小鼠的动能协调能力显著降低,与JWAWT相比,JWACKO小鼠爬杆时时间延长了 48%,运动的总距离下降了 42%,棒上的时间下降了 45%。3.星形胶质细胞JWA基因缺失能够导致小鼠中脑SNc区DA神经元的丢失,与对照组相比下降25%,而在MPTP/p诱导后TH神经元的丢失更为明显,与JWAWT相比神经元丢失了 37%;星形胶质细胞JWA基因缺失可以诱导小鼠中脑SNc区星形胶质细胞增殖活化,与对照组相比GFAP阳性细胞数增加了210%,表现为星形胶质细胞胞体增大,并且在MPTP/p刺激后星形胶质细胞活化的更加明显与JWAWT相比GFAP阳性细胞数增加了 20%。星形胶质细胞JWA基因缺失加重MPTP/p诱导的中脑谷氨酸转运蛋白GLT-1的表达量降低;在体外模型上,发现JWA高表达可以引起GLT-1的表达增加,对GLAST没有显著的影响。MPP+的刺激能够降低C8D1A中JWA的表达,但并没有改变JWA对GLT-1的调控。4.在星形胶质细胞细胞株C8D1A上高低表达JWA,检测相关信号通路的变化,结果显示,JWA正调控MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路;并且JWA能够改变C8D1A对谷氨酸的摄取能力。低表达JWA可以显著降低C8D1A的谷氨酸摄取能力其摄取量只有对照组的55%,相反,高表达JWA可以使谷氨酸摄取能力增加185%。JWA能够在转录水平对GLT-1进行调控,低表达JWA可以降低45%GLT-1的表达,转染高表达质粒可以使GLT-1的表达增加210%。但对GLAST没有明显的影响。5.JWA能够正调控GLT-1转录因子CREB的磷酸化程度,对转录因子YY1没有影响,对转录因子NF-κB呈负调控;采用ERK及Akt的抑制剂可以反转JWA对GLT-1及p-CREB调控,并且可以相应的改变谷氨酸的摄取能力;通过条件性上清刺激神经元发现JWA敲除的星形胶质细胞上清能够加重MPP+对神经元的毒性。6.在原代星形胶质细胞中对以上的结果进行验证,同样的JWA能够在转录及蛋白水平调控GLT-1的表达;在原代星形胶质细胞上低表达JWA对谷氨酸的摄取能力会降低44%,而高表达可以引起谷氨酸摄取能力增加163%,JWA敲除小鼠的星形胶质细胞的体外培养同样显现出GFAP的表达增加。7.星形胶质细胞JWA基因缺失小鼠在纹状体、中脑、海马、下丘脑及皮层均发现了明显的星形胶质细胞活化的现象,细胞形态表现为短而厚,免疫印迹显示这些星形胶质细胞STAT3的本底和磷酸化水平都显著增加,并且GFAP的表达也相应地增加;在野生型小鼠,星形胶质细胞则呈现未被激活的薄而细的形态。在体外培养的星形胶质细胞C8D1A,免疫印迹的发现,高表达JWA抑制STAT3本底和磷酸化水平以及GFAP表达;而低表达JWA则促进了 STAT3本底表达水平和磷酸化以及GFAP表达。8.星形胶质细胞JWA基因缺失能够增加小鼠对百草枯的敏感性,表现为行为学上运动能力障碍、单胺类递质的降低、星形胶质细胞的活化及DA神经元的丢失;并且GLT-1的表达情况也受到了明显的抑制。9.高表达JWA能增强C8D1A对MPP+抵抗能力,相反,低表达增加细胞对MPP+的敏感性;JWA能够影响细胞谷胱甘肽的含量,高表达JWA增加了 45%GSH含量,相反,低表达则减少48%GSH的含量;JWA高表达可以显著增加Nrf2(增加33%)及其下游分子NQO1(增加35%),HO-1(增加167%),GCLC(增加112%)、GCLM(增加41%)的表达水平。其低表达能显著降低Nrf2(降低 49%)、NQO1(降低 19%)、HO-1(降低 61%)、GCLC(降低 25%)的表达量,但JWA对神经营养因子BDNF及GDNF的表达没有明显影响。si-Nrf2能够逆转高表达JWA对Nrf2下游分子的调控。结论:本研究采用动物模型并结合细胞实验,利用分子生物学的技术手段从多个角度阐明了星形胶质细胞JWA基因的缺失能够增加小鼠对MPTP及百草枯的敏感性。在机制研究中,我们首次发现JWA能通过MAPK/ERK及PI3K/Akt两条信号通路激活下游的CREB转录因子对下游的GLT-1产生调控,并最终引起细胞外间隙谷氨酸含量的改变。这些发现从另一个角度为PD治疗提供了新的思路,为制定针对星形胶质细胞JWA为靶点的治疗方案提供科学依据。