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恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一,除传统的手术及放化疗外,利用肿瘤免疫疗法激发T细胞的杀伤活性来控制肿瘤生长已成为临床治疗中不可或缺的手段之一。T细胞可及时识别并清除体内异物或癌变细胞,在抗肿瘤免疫反应中发挥重要功能。T细胞活化需要两个信号的协同作用,除了 T细胞受体(TCR)与抗原肽-MHC分子复合物结合产生的第一刺激信号外,还需要T细胞表面的协同刺激分子提供第二刺激信号。免疫检查点是免疫系统中起抑制作用的第二刺激信号分子,可抑制T细胞的活性,避免引起过激的免疫反应,在机体免疫应答过程中发挥关键调节作用。PD-1(Programmed Death 1),又称程序性死亡受体-1,是目前研究较为成熟的免疫检查点分子,属于免疫球蛋白超家族,主要表达于T细胞表面。PD-1的配体为PD-L1(Programmed Death-Ligand 1),又称程序性死亡配体-1。PD-L1存在不同的糖基化修饰形式,主要表达于抗原提呈细胞(APC)或肿瘤细胞表面。PD-1与PD-L1的胞外相互作用可抑制T细胞杀伤反应,导致肿瘤细胞免疫逃逸,近年来PD-1/PD-L1已成为临床上治疗不同类型癌症的热门靶点。生物膜蛋白提取结果显示位于肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞膜上PD-L1蛋白以糖基化形式存在。因此,本研究建立了一个针对糖基化PD-L1膜蛋白的高通量药物筛选模型,经筛选发现新一代表皮生长因子受体EGFR抑制剂ES-072有效增强PD-L1膜蛋白的降解并削弱PD-1/PD-L1的相互作用。进一步实验表明,EGFR参与调控PD-L1的蛋白酶体降解过程。由于EGFR属于蛋白激酶,我们推测EGFR通过调控PD-L1膜蛋白磷酸化影响该蛋白的稳定性和功能发挥。利用磷酸化质谱技术,我们鉴定到两个位于PD-L1胞内段的磷酸化位点,S279和S283。模拟去磷酸化实验结果显示,S279/S283磷酸化有效调控PD-L1膜蛋白泛素化依赖的降解以及与PD-1的相互作用。质谱分析结果提示,与糖基化PD-L1膜蛋白存在相互作用的激酶中,ES-072显著增强GSK3α与PD-L1的相互作用,提示EGFR可能通过GSK3α调控PD-L1膜蛋白的磷酸化。体外激酶实验结果证实GSK3α可直接磷酸化PD-L1,且作用位点为S279/S283。小鼠乳腺癌移植瘤模型和临床肺癌病人实验结果显示,ES-072显著抑制肿瘤生长且调控肿瘤微环境中相关巨噬细胞的变化。本研究揭示了 EGFR调控PD-L1膜蛋白降解及其与PD-1相互作用的新机制,为肿瘤免疫治疗中靶向药物的研发以及联用方案提供理论基础和实验依据。