【摘 要】
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[目的]确定布鲁氏菌病Tb 噬菌体增殖培养、传代、保存及灭活的生物学参数,为科学繁殖和正确使用布鲁氏菌病Tb 噬菌体提供参考.[方法]预先将200ul 布鲁氏菌A19(1010CFU/ml)接种100ml TSB 培养基,按37℃、200rpm 振荡培养不同时间(0h、2h、4h、6h 和8h),分别加入200ul Tb(105RTD),在振荡培养不同时间点(12h、24h、48h 和72h)分别
【机 构】
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中国兽医药品监察所 北京 100081
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[目的]确定布鲁氏菌病Tb 噬菌体增殖培养、传代、保存及灭活的生物学参数,为科学繁殖和正确使用布鲁氏菌病Tb 噬菌体提供参考.[方法]预先将200ul 布鲁氏菌A19(1010CFU/ml)接种100ml TSB 培养基,按37℃、200rpm 振荡培养不同时间(0h、2h、4h、6h 和8h),分别加入200ul Tb(105RTD),在振荡培养不同时间点(12h、24h、48h 和72h)分别收获噬菌体,进行RTD(临界试验稀释裂解法)含量测定考察其合适的增菌时间和收获点；进一步分别以200ul 不同A19菌液浓度(104、106、108、1010)CFU/ml 和200ul 不同Tb 含量(103、105、107)RTD 为各自参数变量收获噬菌体进行含量测定,考察繁殖所需适宜的菌液浓度及Tb 浓度.将Tb 以A19 为宿主菌同条件连传5 代,取第1、3、5 代进行含量测定,确定其传代性能；将Tb 冻干,一并与液体Tb 在-15℃、2～8℃和37℃分别保存2 个月,期间取2 周、4 周、6 周及3 个月进行RTD 测定,确定其合适保存方式.将Tb 分别用等量的不同牛种布鲁氏菌参考菌株(A19、104M、2308、RA343)同条件培养收获噬菌体,测定其含量,以评估其不同菌株的裂解能力；接着运用紫外线照射不同时间(15min、1h、2h),80℃水浴不同时间(5min、30min、1h、3h)以及消毒剂(70％乙醇、1％新洁尔灭、过硫酸氢钾)作用5min 评估不同理化因子的消毒效果.[结果]预先将A19 振荡培养增菌6h 接Tb 毒,在37℃、200rpm 振荡培养24～48h 收获的Tb 噬菌体含量最高(达107RTD).不同菌液浓度培养繁殖噬菌体结果表明,菌数与Tb 繁殖量呈正相关关系,菌液浓度为1010CFU/ml收获的噬菌体含量最高,达到107RTD；不同浓度Tb 增殖培养噬菌体效果表明,Tb 接种的浓度为107 RTD 时,其收获的Tb 噬菌体含量最高(达107RTD).传代检测结果显示,连传5 代,Tb 病毒含量逐步升高并保持稳定,其第1,3,5 代含量分别为：106RTD、107RTD、107RTD.冻干Tb及液体Tb 在-15℃、2～8℃均可保存3 月,而37℃时,冻干Tb 可稳定保存1 个月,液体Tb 可稳定保存2 周.Tb 对不同菌株裂解试验结果表明,其具有广谱的裂解光滑型牛种布鲁氏菌能力,对粗糙型布鲁氏菌裂解作用较小,最适宜的增殖宿主菌为A19 和104M.不同理化因子灭活试验结果显示紫外线照射有灭活效果,照射15min、1h、2h 和6h,病毒含量分别下降1-2 个滴度(RTD为104-105)、2-3 个滴度(RTD 为103-104)、4-5 个滴度(RTD 为102-103)和完全灭活.而80℃水浴加热5min 可下降3 个滴度,30min 即可完全灭活；70％乙醇、1％新洁尔灭作用10 分钟则无法完全灭活,而0.5％过硫酸氢钾消毒液完全灭活.[结论]运用A19 疫苗株液体培养繁殖Tb,可获得较高的、稳定病毒含量的噬菌体,该噬菌体可以以冻干方式和液体方式实现较长期保存,并具有广谱的裂解布鲁氏菌能力,能够被常见的理化因子有效灭活.
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