【摘 要】
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目的：克隆西藏小型猪OBR基因并原核表达ECD近跨膜区重组融合蛋白。方法：(1)根据猪OBR基因序列(GenBank号：AF092422.1)设计并合成5条特异性引物,以西藏小型猪肝脏组织总RNA为模板,经RT-PCR方法获得了OBR基因ECD(胞外域)和ICD(胞内域)片段；再以这两片段为模板,利用Overlap PCR法扩增OBR基因全cDNA序列,序列测定后与GenBank上报导的其它动物作
【机 构】
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南方医科大学实验动物中心暨比较医学研究所,广州 510515 东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司,东莞 523808
【出 处】
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2011东莞第二届国际小型猪学术论坛暨大型实验动物生物医药研究应用研讨会
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目的：克隆西藏小型猪OBR基因并原核表达ECD近跨膜区重组融合蛋白。方法：(1)根据猪OBR基因序列(GenBank号：AF092422.1)设计并合成5条特异性引物,以西藏小型猪肝脏组织总RNA为模板,经RT-PCR方法获得了OBR基因ECD(胞外域)和ICD(胞内域)片段；再以这两片段为模板,利用Overlap PCR法扩增OBR基因全cDNA序列,序列测定后与GenBank上报导的其它动物作同源性比较及亲缘进化树分析。(2)另设计1对带有BamHI和HindⅢ酶切位点特异性引物,扩增OBR基因ECD近跨膜区(1705-2364bp),经酶切后连接到表达载体pRSETA的BamH I和HindIII两酶切位点之间,构建重组表达质粒并在大肠杆菌E.coliBl。2l(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳分析和western blotting鉴定表达产物。结果：(1)同源性比较及亲缘进化树分析显示,与广西巴马小型猪、家猪的亲缘性最高(99.6%),其次奶牛(91.1%),再次犬(90.0%),人类为88.3%；(2)SDS-PAGE电泳分析和westernblotting鉴定结果显示,在IPTG诱导下OBR基因克隆及ECD近跨膜区重组表达菌表达了相对分子质量约27.6KDa左右的融合蛋白。结论：成功表达西藏小型猪ECD近跨膜区融合蛋白,为下一步研究OBR基因的功能、研究肥胖发病机制、探寻预防与控制肥胖方法奠定基础。
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