论文部分内容阅读
目的观察二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生的作用,并揭示AMPK/Smad信号通路在其中的作用。方法利用大鼠肝星状细胞株HSC-T6为研究对象,以TGF-β1(5ng/ml)处理2 h后,再以不同浓度的DHM处理24 h。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;ELISA法检测细胞分泌的ECM包括MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ的水平;免疫荧光细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;qRT-PCR法检测MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的mRNA表达水平;Western blot法检测Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7、AMPK、p-AMPK蛋白表达;采用AMPK抑制剂(Compound C)、激动剂(AICAR)及siRNA分别预处理HSC-T6细胞,western blot检测Smads蛋白的磷酸化和表达。结果 CCK-8法检测结果显示,DHM能显著抑制TGF-β1诱导的细胞增殖活力的增加(P﹤0.05);流式细胞术检测细胞凋亡表明,DHM能够明显促进TGF-β1诱导的HSC-T6细胞凋亡,并抑制TGF-β1诱导的细胞G0/G1期比例降低、S期和G2/M期的细胞比例增加(P﹤0.05);ELISA检测结果表明,DHM能够显著抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞上清液中TIMP-1和COL-Ⅰ水平增高及MMP-1水平下降(P﹤0.05);免疫荧光细胞化学法检测显示,HSC-T6细胞表达HSC活化特定抗原α-SMA,TGF-β1处理后表达增加,而DHM能够抑制α-SMA表达; qRT-PCR结果显示,DHM能够显著影响TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的细胞外基质相关基因MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7等的mRNA表达;Western blotting检测结果提示,DHM抑制了TGF-β1诱导的AMPK磷酸化下降、Smad2/3的磷酸化水平升高及Smad7的蛋白表达下降,而AMPK抑制剂Compound C和siRNA处理后,DHM的作用被显著抑制。结论 DHM能够显著抑制HSC细胞的活化及ECM产生,该作用可能与促进AMPK的磷酸化进而抑制Smad2/3蛋白的磷酸化,减少ECM相关基因表达有关。