【摘 要】
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目的 构建稳定Ⅰb型骨形态发生蛋白受体过表达及显性负性突变的神经干细胞,为下一步研究BMPs调控NSCs分化机制奠定基础.方法 利用RT-PCR及定点突变技术克隆小鼠BMPR Ⅰ b
【机 构】
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陕西省西安交通大学医学院第二附属医院骨二科,陕西西安710004
【出 处】
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第一届全国脊柱脊髓损伤治疗与康复技术研讨会暨2014年海南省医学会骨科学术年会
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目的 构建稳定Ⅰb型骨形态发生蛋白受体过表达及显性负性突变的神经干细胞,为下一步研究BMPs调控NSCs分化机制奠定基础.方法 利用RT-PCR及定点突变技术克隆小鼠BMPR Ⅰ b及突变BMPR Ⅰ b(Dn-BMPR Ⅰ b)基因,然后利用基因重组技术将目的基因分别定向插入慢病毒表达质粒,构建重组慢病毒质粒.经酶切及测序鉴定后,利用磷酸钙方法进行共转染包装细胞293T,浓缩慢病毒载体并测定滴度.利用获得的慢病毒载体感染NSCs,并对感染后细胞增殖、分化及目的基因表达情况进行鉴定.结果 测序结果显示成功克隆BMPR Ⅰb及Dn-BMPR Ⅰb基因,经双酶切鉴定、质粒测序及绿色荧光蛋白观察证实成功构建携带BMPR Ⅰb及Dn-BMPR Ⅰb基因的慢病毒载体,病毒滴度分别为5×108、6×108TU/ml.BMPR Ⅰ b组及Dn-BMPR Ⅰ b组NSCs在荧光显微镜下表达绿色荧光蛋白.经RT-PCR结果显示BMPR Ⅰb组及Dn-BMPR Ⅰb组NSCs BMPR Ⅰ b/Dn-BMPR Ⅰ b mRNA明显高于空白对照组NSCs (P＜0.05),且Dn-BMPR Ⅰb组NSCs Smad4mRNA表达量明显低于其它两组(P＜0.05).结论 成功构建稳定BMPR Ⅰ b过表达及显性负性突变BMPR Ⅰb的NSCs,可供下一步实验.
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