背景与目的:原发性肝癌是全世界最常见的肿瘤之一,其死亡率在癌症相关死亡中位居第四,其中最常见的是肝细胞癌,约占原发性肝癌的95%。由于肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力较强,并且对放化疗等治疗手段不敏感,其治疗方式仍以手术切除为主。然而大部分患者发病时已处于中晚期,只有10~23%的患者适合手术治疗。如何对肝癌患者作出早期诊断及发现新的治疗靶点是肝癌研究领域亟待解决的关键科学问题。虽然目前对肝癌的病因已有一定的了解,但肝癌形成和发展的分子机制并不完全清楚。因此,深入探索肝癌发生发展的分子机制,将有助于发掘重要的分子靶点,为肝癌的分子诊断及靶向治疗奠定基础。FOXM1是Forkhead Box(Fox)转录因子家族的成员之一,在细胞周期G1/S及G2/M的过渡转变中起关键作用。FOXM1在静止期细胞中几乎不表达,而在细胞增殖过程中其表达水平明显升高,通过转录调控其下游与细胞周期相关的靶基因的表达从而影响细胞DNA复制和有丝分裂进程。FOXM1在DNA损伤修复、血管生成、组织再生、细胞凋亡和肿瘤细胞的侵袭与迁移及肿瘤化疗抵抗等多种生物学功能中发挥重要作用。因此探索FOXM1在肿瘤发生发展过程中的作用及具体机制将有助于阐明肿瘤的发病机理,为发现新的肿瘤治疗靶点提供理论依据。目前认为,肝细胞癌的恶性增殖是由一系列的基因及其调控网络的改变所导致的,而转录因子FOXM1及其所调控的下游基因网络在此过程中发挥重要作用。然而,其中确切的致癌机制仍然不明确。肝癌中的基因调控网络有哪些?FOXM1及其调控的基因网络如何在肝癌中被激活?FOXM1及其调控基因网络如何在肝癌的发生发展中发挥功能?针对这些问题,我们将以肝癌为研究对象,以FOXM1及其基因调控网为研究重点,从生物信息学、临床队列、分子生物学、细胞功能学以及实验动物学等多方面开展深入研究,为肝细胞癌的基因诊断和分子靶向治疗提供新的理论依据。材料与方法:基于公共数据平台GEO数据库中肝细胞癌的表达谱芯片数据集,进行meta分析寻找肝细胞癌中显著差异表达的基因;针对TCGA数据库中的肝癌临床样本数据集进行bayesian分析得到差异表达基因,将其与meta分析结果进行聚类,再将聚类分析结果与肝癌细胞中可能的增殖相关基因进行交集,确定在肝细胞癌中表达上调的基因。2、临床队列研究验证生物信息学分析结果(1)收集临床肝细胞癌样本,通过western blot及免疫组织化学染色分析FOXM1和KIF4A在临床肝细胞癌样本及对应癌旁正常组织中的蛋白表达水平变化;(2)使用“德国半定量”系统评分法对免疫组织化学检测结果进行统计,利用卡方检验分析FOXM1和KIF4A表达与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性,通过Kaplan-Meier生存曲线及Log rank检验分析FOXM1和KIF4A表达水平的变化对肝细胞癌患者生存预后的影响。3、FOXM1和KIF4A在肝细胞癌中异常活化的分子机制探讨(1)在肝癌细胞中过表达或者干扰FOXM1后检测KIF4A表达水平的变化,确定FOXM1与KIF4A之间的表达调控关系;(2)利用生物信息学预测KIF4A上游潜在的转录调控因子;在线网站预测转录因子FOXM1在KIF4A基因启动子区潜在的结合位点;(3)通过染色质免疫共沉淀及双荧光素酶报告基因系统验证KIF4A是否是FOXM1的直接靶基因。4、FOXM1和KIF4A在肝细胞癌恶性增殖过程中的生物学作用初探(1)利用慢病毒感染系统构建FOXM1和KIF4A分别过表达或者干扰的肝癌稳定细胞株;(2)通过Ed U、平板克隆形成实验、连续细胞计数实验、CCK-8实验及细胞周期检测等探索FOXM1和KIF4A在肝癌细胞增殖、克隆形成、细胞生长速率、细胞活力和细胞周期进程中的影响。5、FOXM1-KIF4A信号轴对肝细胞癌恶性生物学行为机制的研究(1)构建同时过表达FOXM1和干扰KIF4A的肝癌稳定细胞系;(2)体外细胞水平通过Ed U、平板克隆形成实验、连续细胞计数、CCK-8实验及细胞周期检测等探究FOXM1-KIF4A信号轴对肝细胞癌恶性增殖行为的作用;1、生物信息学分析肝细胞癌中的基因表达谱变化(3)体内肝癌裸鼠移植瘤模型验证FOXM1-KIF4A信号轴对肝细胞癌肿瘤细胞增殖的影响。结果:1、生物信息学分析发现18个在肝细胞癌中上调表达的基因依据入组标准,整合GEO和TCGA两大数据库的肝细胞癌相关数据进行生物信息学分析筛选,发现了59个表达上调的基因和51个表达下调的基因。经与肝癌细胞增殖的基因进行聚类分析,最终得到包括FOXM1和KIF4A在内的18个表达上调的基因。2、FOXM1及KIF4A在肝癌组织中异常高表达并显著影响肝癌患者临床预后(1)Western blot与免疫组织化学染色检测FOXM1与KIF4A在肝癌组织与对应癌旁正常组织中的表达情况,结果显示二者在癌组织中表达高于对应的癌旁正常组织。(2)免疫组化及在线网站分析显示FOXM1与KIF4A在肝癌组织中表达呈正相关。(3)临床病理相关性分析显示高表达的FOXM1与肿瘤大小、肿瘤病理分级及肿瘤TNM分期相关;高表达的KIF4A与肿瘤大小、病理分级、脉管浸润及TNM分期有关。并且FOXM1和KIF4A高表达的肝癌患者总生存期及无病生存期缩短。3、KIF4A是转录因子FOXM1的直接靶基因(1)在FOXM1相对低表达的Hep G2、Sk-hep1及中等表达的Huh7细胞中梯度转染FOXM1的过表达质粒后,western blot及real-time PCR检测结果显示KIF4A的蛋白和m RNA表达水平都明显上调;(2)在FOXM1相对中高表达的Huh7及Hep3B细胞中梯度转染FOXM1的干扰质粒后,KIF4A的蛋白和m RNA水平都明显下调;(3)UCSC在线网站分析显示FOXM1可能是KIF4A的上游转录调控因子;(4)生信预测发现KIF4A启动子区存在四个FOXM1的潜在结合位点,而染色质免疫共沉淀证实FOXM1能与其中三个位点结合;(5)双荧光素酶报告基因系统检测结果显示FOXM1与KIF4A启动子结合后能够转录调控KIF4A的表达,结合位点突变的荧光素酶报告实验证实BS3位点(5’-AGATGGAGT-3’)是FOXM1的功能结合位点。4、FOXM1和KIF4A促进肝癌细胞恶性增殖(1)与对照组相比,过表达FOXM1或者KIF4A的肝癌稳定细胞株的Ed U细胞增殖速率加快,细胞的克隆形成能力、细胞生长能力以及细胞活力都显著增强;(2)抑制FOXM1或者KIF4A的表达后,肝癌稳定细胞的Ed U阳性细胞百分比显著降低、克隆形成能力减弱,细胞生长速率减慢,细胞的生长活力也显著降低;(3)干扰FOXM1蛋白表达后肝癌细胞出现细胞周期阻滞,表现为S期细胞分布显著减少,G1期细胞显著增多;(4)干扰KIF4A表达后肝癌细胞无法实现正常的有丝分裂及胞质分裂,表现出G2M期阻滞以及多倍体细胞的形成。5、FOXM1促进肝癌细胞增殖的恶性生物学行为依赖于KIF4A的正常表达(1)体外实验结果表明相比Vector+sh-Control组,FOXM1+sh-Control组肝癌稳定细胞的Ed U阳性细胞百分比明显升高,克隆形成能力、细胞生长能力及细胞活力都显著增强;而在此基础上干扰KIF4A表达后,FOXM1+sh-KIF4A组细胞的Ed U细胞增殖能力、克隆形成能力、细胞生长能力及细胞活力都受到明显抑制;(2)细胞周期实验结果显示FOXM1+sh-Control组比对照组Vector+sh-Control分布在S期的细胞比例更多;而在此基础上干扰KIF4A表达后,FOXM1对Hep G2细胞周期进程的推进作用被明显抑制,表现为相比FOXM1+sh-Control组,FOXM1+sh-KIF4A组的S期细胞显著减少,并出现G2M期阻滞和多倍体细胞的形成;(3)体内研究表明FOXM1能够促进肝癌细胞的体内增殖,而在FOXM1过表达的基础上干扰KIF4A表达后肝癌裸鼠移植瘤的生长速率、瘤体重量均明显抑制;剥离瘤体组织的western blot及免疫组织化学检测证实过表达FOXM1后其下游靶基因KIF4A、CENPF和CCNB1以及细胞增殖相关标记分子Ki67表达上调,而抑制KIF4A的表达后增殖标记分子Ki67的蛋白表达降低。结论:1、FOXM1与KIF4A在肝癌组织中异常高表达,二者呈现正相关,并且与肝癌患者不良预后相关。2、KIF4A是转录因子FOXM1的直接下游靶基因;FOXM1通过与KIF4A启动子区结合调控KIF4A的表达。3、FOXM1介导的肝癌细胞增殖依赖于KIF4A的表达