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目的:观察AS患者髋关节滑膜单核-巨噬细胞RANKL/RANK信号通路的活化情况,及补肾活血方药对其干预作用,探索补肾活血方药对AS骨破坏的防治作用及分子机制.
方法:以体外培养的滑膜中单核-巨噬细胞作为研究对象.滑膜组织来自10例AS患者以及10例正常对照组.AS组滑膜来自行全髋关节置换术的AS患者,正常对照组滑膜来自因股骨颈骨折须行髋关节置换的患者,滑膜均为手术废弃物,且滑膜获得符合伦理要求.运用免疫组化二步法检测组织中相关蛋白表达情况,运用酶消化法及贴壁粘附培养分离滑膜组织中单核-巨噬细胞,运用流式细胞术鉴定细胞,运用MTT法检测细胞生长情况,制备补肾强脊汤含药血清干预细胞,运用Western blot及RT-PCR检测干预前后细胞中RANKL/RANK信号通路各级信号分子RANK、TRAF6、NF-κB、JNK、ERK、p38和破骨细胞标志蛋白TRAP及参与骨吸收的蛋白CATK、MMP3的mRNA以及蛋白表达情况.
结果:成功建立单核-巨噬细胞细胞系,经流逝细胞术鉴定,培养细胞中单核-巨噬细胞比例为55.3±4.2％.经Western blot检测,AS单核-巨噬细胞表面大量表达RANKL的受体RANK,且TRAF6、NF-κB、JNK、ERK、p38、NFATc1等高表达,AS单核-巨噬细胞中破骨细胞标志蛋白TRAP及参与骨吸收的蛋白CATK、MMP3的表达均较正常组升高,以上P＜0.05,差异均有统计学意义.经RT-PCR证实,AS患者滑膜中RANK、TRAP基因表达明显升高,与正常组比较,差异显著,P＜0.05.运用补肾活血方药干预细胞后,中药组的RANK、TRAF6、NF-κB、JNK、ERK、p38、NFATc1,破骨细胞标志蛋白TRAP及参与骨吸收的蛋白CATK、MMP3较AS组显著降低,P＜0.05;RANK、TRAP基因表达明显降低,与正常组比较,差异显著,P＜0.05.
结论:AS患者单核-巨噬细胞中RANKL/RANK信号通路被高度激活,滑膜中存在大量单核-巨噬细胞向破骨细胞分化成熟.补肾活血方药可能通过阻断RANK或胞内系列信号转导通路蛋白分子(TRAF6、NF-κB、.JNK、ERK、p38、NFATc1)的表达,下调破骨细胞标志蛋白分子(TRAP)、参与骨吸收的CATK、MMP3蛋白表达,阻断RANKL/RANK信号通路的激活,抑制单核-巨噬细胞向破骨细胞的定向分化,从而发挥抗骨破坏的作用.