保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)是昆虫体内最重要的两类内分泌激素。昆虫的生长、蜕皮及变态严格受到JH和20E的协同调控。其中,JH主要维持幼虫的生长,而20E则在幼虫蜕皮和幼虫到蛹及蛹到成虫的变态发育过程中发挥主导作用。研究JH和20E合成的调控,将有助于完善昆虫内分泌作用的分子机理。家蚕是一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫研究的模式生物。尽管家蚕JH和20E的合成途径及信号传导通路研究已有很多积累,但JH和20E合成的分子调控机制仍有待深入探究。本研究以JH和20E合成相关基因为靶标,利用生物信息学分析、遗传操作及生物化学和分子生物学多种实验方法,在细胞、组织、个体水平探究了家蚕homeodomain转录因子对JH和20E合成的调控机制。获得的主要研究结果如下:1.Homeodomain转录因子Scr对家蚕JH合成的调控1))家蚕显性三眠突变家蚕显性三眠突变变((M3))幼虫初期幼虫初期JH滴度升高相比于有5个幼虫龄期的野生型(WT)家蚕,显性三眠突变(M3)家蚕的幼虫虽然只经历4个龄期,但其2龄和3龄龄期明显延长,体长和体重自2龄开始显著增加,4龄时的虫体大小已与WT的5龄幼虫相当。M3在4龄末上簇,进入由幼虫到蛹的变态发育。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的方法,我们测定了M3及WT幼虫期JH的滴度变化。结果表明,JH滴度在M3和WT中均随幼虫生长发育逐渐降低,且在各龄初期最高,之后迅速下降,眠期降至最低。值得注意的是,二龄期M3的JH滴度明显高于WT。q RT-PCR分析显示,JH应答及信号传导基因Kr-h1的时期表达模式与JH滴度的变化趋势一致。此外,我们利用放射性免疫(RIA)的方法测定了M3及WT幼虫期20E的滴度变化。结果表明,在两个家蚕品系中,20E滴度均呈现在各龄初期最低、后期逐渐上升、眠期及上蔟期达到峰值的变化趋势,且在M3和WT中无明显差异。q RT-PCR分析显示,20E应答及受体基因Ec R在M3和WT中的时期表达模式无明显差异。上述结果暗示,二龄初期较高的JH滴度与M3的突变表型密切相关。我们用保幼激素类似物(JHA)烯虫酯(methoprene)处理WT的2龄起蚕来分析JH对家蚕生长发育的影响。结果表明,与对照相比,大部分经JHA处理的家蚕幼虫各龄龄期有所延长,虫体显著增大。更重要的是,其中少数个体于4龄末期提前上簇并开始变态发育,表现出与M3极其相似的表型。这表明对2龄起蚕进行JHA处理不仅能够延长幼虫龄期,而且能够诱导家蚕由四眠向三眠转化,进一步暗示二龄期较高的JH滴度是导致M3突变的主要原因。2)Scr基因因与与M3突变位点紧密连锁鉴于M3突变位点已被定位在家蚕6号染色体的24.1 c M附近,我们以家蚕基因组精细图序列为基础,采用定位克隆的策略对M3突变的潜在主控基因进行了鉴定。结果显示,M3突变位点被锁定于家蚕6号染色体Bm_nscaf2853上约117.5 kb的区域内。该区域仅包含一个预测的蛋白编码基因,即homeodomain转录因子Scr(Sex combs reduced)编码基因。进一步的分析显示,M3和WT中Scr基因的编码区序列没有差异。但与WT相比,M3的Scr基因在第二内含子中存在多处转座元件的插入或缺失,推测其很可能与M3的突变表型相关。3)Scr调控JH合成相关关基因的转录基因的转录鉴于Scr基因与家蚕M3突变连锁,而M3突变的发生又与JH滴度的异常变化相关,我们推测Scr基因可能参与了家蚕JH合成的调控。为验证这一假说,我们首先分析了Scr基因在WT家蚕幼虫脑-心侧体-咽侧体(Br-CC-CA)复合体及前胸腺(PG)中的时期表达模式,其中CA和PG分别是JH和20E前体的合成场所。结果表明,Scr在Br-CC-CA中的时期表达模式与JH滴度的时期变化较为一致,而在PG中的时期表达模式与20E滴度的变化并无紧密联系。此外,我们在家蚕胚胎来源的细胞(Bm E)中过表达了Scr基因,q RT-PCR分析显示,Scr基因过表达能够诱导JH合成相关基因上调表达,但20E合成相关基因的表达却不受影响。上述结果暗示,Scr可能通过调控JH合成相关基因的转录来影响家蚕JH的合成。在线预测分析发现,Allototropin、FPPS2及JHAMT等JH合成相关基因的启动子区域存在homeodomain转录因子的保守顺式调控元件。我们进一步开展了启动子截短、荧光素酶活测定以及凝胶阻滞分析(EMSA)等一系列实验。结果证实,Scr能够直接结合Allototropin、JHAMT及FPPS2启动子区域的相关顺式调控元件。这表明Scr可直接调控JH合成相关基因的转录,从而实现对家蚕JH合成的调控。2.Homeodomain转录因子Antp和POU-M2对家蚕20E合成的调控1)Antp和POU-M2通过过蛋白互作共蛋白互作共共同同同调控调控20E合成酶基因因的转录的转录在线预测分析发现,Spook、Shroud、Phantom、Disembodied、Shadow等家蚕20E合成酶基因的启动子区域存在多个homeodomain转录因子Antp(Antennapedia)及POU-M2的顺式调控元件。q RT-PCR结果表明,Antp和POU-M2在家蚕幼虫PG中的时期表达模式与20E合成酶基因的类似。这些线索暗示Antp和POU-M2可能对家蚕20E合成酶基因的转录具有调控作用。我们重点分析了Antp和POU-M2对家蚕20E合成酶基因Phantom的转录调控作用。启动子截短、荧光素酶活测定、EMSA、染色质免疫共沉淀(Ch IP)等一系列实验的结果证明,Antp和POU-M2通过直接结合Phantom启动子上的顺式调控元件中相邻的核心基序调控其转录。更重要的是,我们通过pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)等实验发现,Antp和POU-M2对Phantom的转录调控是通过二者的蛋白相互作用来完成的。2)Antp和POU-M2基因的RNAi影响响家蚕家蚕20E合成并并阻断阻断断其其其变态发育变态发育我们开展了家蚕Antp和POU-M2的RNAi实验。首先,我们合成了Antp和POU-M2的ds RNA,并在刚上簇时分别注射家蚕。后续分析显示,在ds RNA注射处理后48小时的家蚕PG中,Antp、POU-M2及大部分20E合成酶基因的表达均被显著抑制,而血淋巴中的20E滴度以及表皮中20E应答基因(Ec R、E74A、βftz-f1和Br-C)的表达也明显降低。ds RNA注射处理后60小时,对照个体已完成化蛹,而干涉个体的变态发育则被阻断并最终死亡。上述结果进一步在个体水平证实,Antp和POU-M2通过直接调控家蚕20E合成酶基因的转录来调节20E的合成。