【摘 要】
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本研究旨在建立一种快速、高效、具备良好特异性和敏感性的弓形虫检测方法.环介导等温扩增技术(LAMP)是一种能快速扩增DNA片段的新型检测方法,具有高敏感性与特异性.基于
【机 构】
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浙江大学动物科学学院,浙江省动物预防医学重点实验室,杭州 310058
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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本研究旨在建立一种快速、高效、具备良好特异性和敏感性的弓形虫检测方法.环介导等温扩增技术(LAMP)是一种能快速扩增DNA片段的新型检测方法,具有高敏感性与特异性.基于弓形虫核糖体DNA第一转录间隔区(ITS-1)序列,本研究设计了6条特异性引物,扩增片段大小约180bp；并对影响反应的温度(60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃)、内外引物浓度比(1：1,2：1,3：1,4：1,5：1,6：1,7：1,8：1,9：1)、Mg2+浓度(1 mmol/L,2 mmol/L,3 mmol/L,4 mmol/L,5 mmol/L,6 mmol/L,7 mmol/L,8 mmol/L,9 mmol/L)、dNTP浓度(0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,1.2 mmol/L,1.4 mmol/L,1.6 mmol/L,1.8 mmol/L)等进行优化；以隐孢子虫、球虫、犬新孢子虫、李斯特菌及猪链球菌的DNA为模板进行特异性检测；将弓形虫DNA从9 ng至0.09 fg10倍梯度稀释,进行灵敏性检测；将建立的LAMP方法用于从浙江省杭州、金华地区屠宰场采集的118份猪肉膈肌样本的检测.结果显示,LAMP的最佳反应体系如下：内外引物浓度比为7：1,Mg2+浓度为6 mmol/L,dNTP浓度为1.4 mmol/L时,在65 ℃恒温条件下扩增30 min,并且LAMP能特异性扩增出弓形虫DNA,最低能检测到0.9 fg/μL的DNA,相比于普通PCR的9fg/μL,LAMP的灵敏性是后者的10倍.临床样品检测结果显示,LAMP检出16份阳性样本,阳性率为13.56％,提示猪肉中有较高的弓形虫阳性率.综上所述,本研究基于ITS-1基因建立了一种可靠的LAMP检测方法,其特异性强,敏感性比普通PCR高,为进一步将该方法转化成商品化试剂盒奠定基础.
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