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紫花苜蓿因其高蛋白含量而被称为"牧草之王",在世界各国广泛种植。病毒病对苜蓿的生产造成严重的危害,近年来,苜蓿病毒病在我国新疆地区盛行,我国研究者对苜蓿病毒病的研究相对较少,对病毒种类缺乏了解。2017年,课题组借助Si-RNA高通量测序初步判断分析出疑似紫花苜蓿病毒病病株中可能携带有菜豆卷叶病毒(BLRV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、白三叶草花叶病毒(WCMV)等病毒。本研究通过对北疆地区紫花苜蓿疑似病毒病病株的采集,采用分子检测技术对新疆北疆地区的紫花苜蓿病毒病害进行了分子检测和鉴定。现报告研究结果如下:(1) 2017—2018年对新疆北疆乌鲁木齐市的乌拉泊、板房沟,昌吉的呼图壁、昌吉阿什里乡以及阿勒泰地区的北屯市、布尔津县、富蕴县等7个区县共采集219个苜蓿疑似病毒病毒株样品,并对此样品进行RT-PCR的检测与鉴定。检测结果表明:供试样品中含有菜豆卷叶病毒(Bean leafroll virus,BLRV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)以及苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)的三种病毒类型。检出率分别为BLRV为25.1%、BYMV为6.8%、AMV为53.4%;样品同时受3种病毒的复合侵染率为2.3%。根据检测结果可知AMV是我国新疆北部地区紫花苜蓿病毒病的优势病原,且有较为明显的复合侵染现象。(2)扩增并克隆了苜蓿的BLRV外壳蛋白基因,运用生物信息学手段对BLRV所对应的蛋白的理化特性以及结构域等进行分析,结果表明,分离得到的955个核苷酸序列位于BLRV基因组的ORF3区域,为衣壳蛋白P3。该序列编码328个氨基酸,分子量(Mw)为22.04 ku,理论等电点(pI)为11.48%。其蛋白为亲水性蛋白。预测三维结构表明,BLRV衣壳蛋白P3无规则卷曲使蛋白倾向于球状构象,这种构象具有高度的特异性,与蛋白质的生物活性密切相关。(3)建立多重RT-PCR的方法可同时检测BLRV、BYMV、AMV三种病毒。通过对多重RTPCR的退火温度、循环参数、引物用量以及灵敏度等方面进行优化设计,建立了可同时检测2～3种病毒的双重以及多重RT-PCR方法。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在25μL反应体系中理想反应条件为退火温度54℃、循环参数35个循环、引物浓度10μmol/L时用到的量为1μL;灵敏度试验表明,3种病毒的最低检测浓度为9.5ng/μL。建立的该多重RT-PCR体系可以准确、快速、灵敏的同时检测出3种病毒。