【摘 要】
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旨在利用CRISPR/Cas9系统建立MyD 88基因敲除的草鱼肾细胞系(CIK)。设计一对草鱼MyD 88靶向基因的导向RNA(sg RNA),构建入p YSY载体。经测序验证,MyD 88前导sg RNA构建成功。
【机 构】
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吉林农业大学动物科学技术学院; 吉林省卫生监测检测中心;
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旨在利用CRISPR/Cas9系统建立MyD 88基因敲除的草鱼肾细胞系(CIK)。设计一对草鱼MyD 88靶向基因的导向RNA(sg RNA),构建入p YSY载体。经测序验证,MyD 88前导sg RNA构建成功。使用Lipo2000,将重组质粒转染CIK细胞,通过流式细胞仪对转染成功细胞进行筛选。提取单克隆细胞系的基因组DNA,genotyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并进行测序。利用Western blot方法检测细胞系中MyD 88的敲除效果,同时MTT法验证获得缺陷系活性。本实验成功构建了草鱼MyD 88基因的CRISPR/Cas9重组质粒,通过genotyping PCR测序和Western blot验证得到一株MyD 88缺陷CIK细胞系,MTT法验证敲除细胞系活性与非敲除细胞活性差异不显著(P>0.05)。本研究获得了一株MyD 88缺陷的CIK细胞系,并且MyD 88不会对细胞正常活性造成影响,为下一步研究病毒免疫提供了良好的模型。
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