【摘 要】
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本课题组前期一系列的研究结果表明：AcSERK1在菠萝(Ananas comosus)体细胞胚发生初期起着关键的调控作用,且在该基因转录起始位点(TSS)上游-921～-880 nt具有胚性细胞特异性启动活性.在此基础上,继续对其5上游-921nt/-880nt区段进行内缺失分析,进一步更精准地鉴定胚性细胞特异性调控序列(或元件)在该区域内可能存在的位置及其结构.分别对该区段进行了不同程度的内缺失
【机 构】
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华南农业大学园艺学院,广州510642
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本课题组前期一系列的研究结果表明：AcSERK1在菠萝(Ananas comosus)体细胞胚发生初期起着关键的调控作用,且在该基因转录起始位点(TSS)上游-921～-880 nt具有胚性细胞特异性启动活性.在此基础上,继续对其5上游-921nt/-880nt区段进行内缺失分析,进一步更精准地鉴定胚性细胞特异性调控序列(或元件)在该区域内可能存在的位置及其结构.分别对该区段进行了不同程度的内缺失,并通过转化菠萝愈伤组织分析鉴定不同缺失区段的胚性细胞特异性.利用JASPAR(http：//jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)在线预测分析发现,在AcSERK1转录起始位点上游-921 nt～-880nt区内含有可与转录因子WRKY家族和MADS-box家族相结合的元件以及一些其他调控元件.根据AcSERK1 TSS上游-921～-880 nt区序列设计8对内缺失特异性引物,使其分别带有用XbaⅠ和HindⅢ将pBI121线性化后的两端和目的片段相互连接处15～20 bp；以菠萝愈伤组织cDNA为模板,进行PCR扩增,电泳回收目的片段；利用Clontech的In-Fusion酶将分别删除TSS上游的-921～-913、-913～-880、-921～-893或-910～-893 nt等较小区段,将删除片段之外的两端序列连接成为一个新的启动子序列(AcSERK1内缺失启动子,AcSERK1 missing promoter),即缺失掉了一些可能与转录因子WRKY家族、MADS-box家族等结合的己知顺式作用元件(如W-box等),缺失长度8～34 bp.使用同源重组法将AcSERK1内缺失启动子取代pBI121载体gus上游35S启动子,42 ℃热激转化至DH5α大肠杆菌,挑取阳性克隆PCR鉴定并测序验证.酶切结果表明,成功构建了分别缺失AcSERK 1 5上游-921～-913、-913～-880、-910～-893和-921～-893 nt 区段的内缺失重组质粒pAS(-921/-913 missing)：：gus、pAS(-913/-880 missing)：：gus、pAS(-910/-893 missing)：：gus、pAS(-921/-893 missing)：：gus.用冻融法将以上重组质粒转化根瘤农杆菌GV3101,挑取平板上的单个阳性菌落进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小.酶切鉴定结果表明质粒插入片段平均长度约2.3 kb,与缺失8～34 bp的AcSERK1起始密码子ATG 5上游调控序列(-2 090～+258 nt)相当；进一步的测序结果证实这些插入片段为目的片段序列,由此确认以上重组质粒均已整合到根瘤农杆菌GV3101基因组中,从而完成了4个AcSERK1 5上游(-921nt/-880nt)区内缺失载体的构建.对这些内缺失载体转化菠萝愈伤组织进行GUS瞬时表达分析,农杆菌介导转化菠萝胚性愈伤组织及其转录活性分析.结果显示胚性细胞特异性调控序列可能是由两个或多个调控元件共同起作用.
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