论文部分内容阅读
为提高表达构件的表达水平和表达稳定性，本文采用CMV组成型启动子和牛as1-CSN基因调控元件组成双启动子调控元件。为检验其表达状况，在上述调控元件中插入hLFcDNA，组成重组构件pbCNCS/LF36，为便于后续体细胞转基因克隆研究筛选出整合克隆细胞，在pbCNCS/LF36后方增加一个Cre/LOxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM.构件pbCNCS/LF36经微注射导入ICR小鼠受精卵中并移入受体，构件pAPLM转染胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果pbcNcS/LF36构件受体妊娠率28.5％，产仔32个，PcR整合检测4只阳性(3♀，1♂，整合率12.5％)；整合阳性小鼠和正常小鼠交配，对F1代检测发现，公鼠所产生后代PcR整合检测均呈阴性，此公鼠为假阳性.构件产生的3只母鼠和4＃后代母鼠在泌乳时，对乳汁作ELISA检测hLF，结果均呈阳性，经半定量测定，3只原代母鼠表达量分别为3.8、2.8、0.9 mg/mL，4＃后代3只母鼠表达量分别为4.2、3.9、3.6mg/mL。构件pAPLM片段导入体外培养的山羊胎儿成纤维细胞，经G418筛选后，挑取单克隆扩大培养，提取细胞基因组DNA进行PCR检测，筛选到8株阳性克隆细胞，通过荧光显微镜观察100％的细胞都有GFP的表达。以上结果证实，pbCNCS/LF36采用双启动子均能在乳腺中特异高水平表达hLF，增加的Cre/LoxP-GFP-Neo系统能表达双标记基因，可提高筛选阳性供核细胞的准确性，这为进一步作体细胞转基因克隆奠定了基础。