目的：恶性肿瘤逃避机体免疫监视和产生免疫耐受的重要原因之一是肿瘤细胞能抑制肿瘤微环境中免疫杀伤细胞的功能.细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)表面的PD-1 与表达于肿瘤细胞表面的配体PD-L1 结合后,将诱导CTL 分泌免疫抑制性细胞因子并导致其发生凋亡,失去杀伤肿瘤的作用.此外,作为肿瘤细胞分泌的特异性蛋白水解酶,明胶酶也在肿瘤侵袭转移中起关键作用,其通过破坏基底膜及细胞外基质的完整性,促进肿瘤生长、侵袭和转移.因此,若能同时阻断PD-1/PD-L1 信号转导途径并抑制明胶酶活性,可望能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移.本研究利用基因重组技术,构建包含靶向明胶酶的抗体片段dFv和PD-1 胞外段的编码DNA 融合基因,并利用原核表达系统获得具有双抑制特异性的dFV-ePD1 融合蛋白,随后研究该融合蛋白对小鼠黑色素瘤B16-F1 细胞的亲和结合能力及对该肿瘤细胞增殖和转移的影响.方法：利用基因工程技术构建重组质粒pET30a(+)/dFV-ePD1,转入E.coli 后经IPTG 诱导表达带有His-tag 的目的蛋白dFV-ePD1,用镍柱纯化获得纯度较高的融合蛋白.运用细胞免疫荧光和免疫组化法分别检测dFV-ePD1 与黑色素瘤细胞及临床组织芯片黑色素瘤组织的结合能力；流式细胞术分析重组蛋白对黑色素瘤的亲和力；MTT 法和Transwell 分别检测重组融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞体外增殖和迁移的抑制作用.结果：成功构建pET30a(+)/dFV-ePD1 原核表达质粒并在E.coli 中表达纯化出dFV-ePD1 融合蛋白.该融合蛋白由dFV(以序贯方式连接的两个抗明胶酶单链抗体片段)和ePD1(PD-1 胞外段)结合而成,相对分子质量约为75KD.细胞免疫荧光和流式细胞术分析显示,dFV-ePD1 融合蛋白能有效结合到黑色素瘤细胞的膜表面,组织芯片免疫组化结果也证实,dFV-ePD1 融合蛋白对黑色素瘤组织的结合能力显著强于正常皮肤组织；MTT 结果显示dFVePD1融合蛋白对黑色素瘤细胞增殖有一定的抑制作用；Transwell 结果表明重组蛋白能抑制黑色素瘤细胞的迁移,且其抑制作用比单独dFV 蛋白更明显.结论：成功制备了基于抗明胶酶单链抗体和靶向PD-L1 的双靶点融合蛋白dFV-ePD1,该融合蛋白对黑色素瘤细胞具有很好的亲和力和体外增殖迁移抑制作用,具有用于临床抗肿瘤免疫治疗的潜在价值.