引言 GeXP系统是用于多基因表达定量分析的平台,在用一PCR体系里由通用引物和特异性嵌合引物引发的多重PCR反应,采用毛细管电泳分离技术,可在同一个体系里对多达30个基因进行有效分析。目前已有一些GeXP技术应用于人的各种疾病检测。鸡免疫抑制性疾病的病原主要包括鸡鸡马立克氏病病毒(MDV)、A、B和J亚群禽白血病病毒(ALV-A/B/J)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽呼肠孤病毒(ReoV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和传染性法氏囊炎病毒(IBDV)。鸡感染这些病毒以后,免疫功能受到抑制,注射疫苗后抗体产生迟缓,抗体水平低,容易继发感染其他细菌性疾病,鸡生长缓慢,是阻碍养鸡行业发展的重要因素。本实验旨在应用本实验室已建立的GeXP系统平台建立一种同时检测8种鸡免疫抑制性疾病病原的多重PCR方法。材料与方法抽提MDV、CIAV、ALV-A、ALV-B、ALV-J和REV相应毒株的DNA(ALV-A、ALV-B、ALV-J和REV为感染细胞的前病毒DNA),ReoV和IBDV的RNA,并反转录为cDNA。每种病原设计一对特异性引物加上通用引物成为嵌合引物,与通用引物组成多重PCR反应体系,进行反应体系奈件优化。并应用建立的反应体系进行特异性试验和敏感性试验,最后应用于临床样品的检测。结果与讨论建立的多重PCR方法特异性良好,经过GeXP毛细管电泳,结果显示,多重引物体系单模板呈现对应单峰,多重引物体系多重模板呈现对应多峰,无非特异性峰,其他病原为模板时无大于2000峰值(峰值大于2000为阳性);敏感性试验显示,8种病毒模板同时检测的最小检测量为每种100copies/20μlPCR反应体系;随机模拟混合感染的情况,与预期相符;建立的方法应用于检测临床样品,结果与单重PCR检测结果相符。嵌合引物的特异性引物部分保证了反应的特异性;嵌合引物的通用引物部分和独立的通用引物保证了每个目的基因都以相同的扩增效率扩增,大大降低了不同引物之间的干扰作用且保证含量低的目的基因也能得到有效扩增;建立的多重PCR方法整个PCR过程只需1.5小时,电泳1小时,具有快速,准确,高通量的优势。结论建立的基于GeXP多重基因表达分析系统的检测鸡免疫抑制病病毒多重PCR方法是一种快速,高通量的新型分子生物学检测方法,可用于临床鉴别检测。