生物质能源是良好的化石能源替代品,乙醇作为比较理想的可再生液体燃料受到国内外科学家的广泛关注。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇发酵生产的主要菌种,也是基因组全序列第一个完成的真核生物,遗传操作性强。作为乙醇生产主要用菌,选育高产乙醇酵母一直是燃料乙醇生产的关键要因。利用分子育种技术改良酿酒酵母已成为发展趋势。酿酒酵母编码乙醇脱氢酶基因主要有五个:adh1、adh2、adh3、adh4、adh5,其中乙醇脱氢酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在发酵过程中执行还原乙醛生成乙醇功能。而乙醇脱氢酶Adh2p却行使催化乙醇生成乙醛的生物学功能,缺失Adh2p活性的酿酒酵母菌株不能在以乙醇为唯一碳源的培养基上生长。ald6基因编码乙醛脱氢酶Ald6p,属于乙醛脱氢酶家族ACDH的一种,执行氧化乙醛至乙酸的生物学功能,是糖酵解过程中乙酸发酵的关键酶。在酿酒酵母adh2基因缺失基础上敲除ald6基因,可有效的降低乙醛到乙酸代谢流,从而进一步增强酵母细胞乙醇合成代谢流,同时还可以降低发酵液中的乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-adh2为出发菌株,应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件,转化酿酒酵母YS2-adh2敲除ald6基因,之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中,半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kan~r基因筛选标记,最后,传代丢失质粒pSH65获得ald6单倍体基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因,最终获得双倍体缺失突变株YS2-adh2-ald6。发酵实验检测,突变株较出发菌株相比乙酸合成量降低18%,乙醇最高产量提高11.65%。