【摘 要】
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本试验的主要目的是探究猪卵丘细胞中miR-155-5p在卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞扩散、卵母细胞成熟中所起的作用以及调节机制,以期为深入研究猪卵母细胞成熟机制和寻找重要的遗传分子标记提供数据支撑和理论依据。本试验在先前课题组进行了RNA-seq测序,比较了生发泡期（GV）和第二次减数分裂中期（MⅡ）卵母细胞周围的卵丘细胞miRNA和m RNA的转录本差异的基础上,从中选择miR-155-5p进
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本试验的主要目的是探究猪卵丘细胞中miR-155-5p在卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞扩散、卵母细胞成熟中所起的作用以及调节机制,以期为深入研究猪卵母细胞成熟机制和寻找重要的遗传分子标记提供数据支撑和理论依据。本试验在先前课题组进行了RNA-seq测序,比较了生发泡期（GV）和第二次减数分裂中期（MⅡ）卵母细胞周围的卵丘细胞miRNA和m RNA的转录本差异的基础上,从中选择miR-155-5p进行研究。使用Target Scan等在线工具预测靶基因,采用q RT-PCR、细胞转染、Western bloingt以及双荧光素酶报告基因检测等方法检测miR-155-5p、CX43、卵丘扩散和卵母细胞成熟相关基因、c AMP通路蛋白的表达变化,以及检测miR-155-5p在卵母细胞体外成熟过程中对卵丘扩散程度、卵母细胞成熟水平的变化。本试验研究结果如下:1.MⅡ期卵丘细胞miR-155-5p的表达量显著高于GV期,而CX43的表达量则显著低于GV期（P＜0.05）;2.与NC组相比,miR-155-5p mimics组COCs卵丘扩散面积极显著提高（P＜0.01）,而miR-155-5p inhibitor组则显著降低（P＜0.05）;体外分离培养的卵丘细胞中mimics组细胞数量和ATP活力极显著提高（P＜0.01）,而inhibitor组则显著降低（P＜0.05）;3.与GV期相比,MⅡ期卵丘细胞中HAS2、PTGS2、CD44、PTX3、TNFAIP6,以及MII期COCs卵母细胞中的GDF9、BMP15和CDK1表达量极显著低于GV期（P＜0.01）,而MⅡ期卵丘细胞中CX43表达量则显著降低（P＜0.05）;4.与对照组相比,mimics组卵丘细胞中HAS2、CD44、TNFAIP6的表达量以及inhibitor组卵母细胞中GDF9、BMP15、和CDK1表达量均极显著升高（P＜0.01）,mimics组卵丘细胞中PTGS2以及inhibitor组卵母细胞中的Cyclin B1表达量显著升高（P＜0.05）,mimics组卵丘细胞中CX43的m RNA和蛋白的表达量分别极显著（P＜0.01）和显著降低（P＜0.05）;而inhibitor组卵丘细胞中HAS2、CD44、PTX3的表达量显著降低（P＜0.05）,inhibitor组卵丘细胞中PTGS2和TNFAIP6以及mimics组卵母细胞中GDF9、BMP15、Cyclin B1和CDK1表达量极显著降低（P＜0.01）,inhibitor组卵丘细胞中CX43的m RNA和蛋白的表达水平则是极显著升高（P＜0.01）;5.与对照组相比,mimics组COCs卵母细胞成熟率显著提高,而inhibitor组则显著降低（P＜0.05）;6.与psicheck2+NC组相比,psicheck2-WT+mimics组可以显著降低荧光素酶活性（P＜0.05）,psicheck2-MUT+mimics荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）;7.与对照组相比,卵母细胞中mimics组PKR2、Cyclin B1和p-CDK1（Thr14,Tyr15）的蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;inhibitor组的PKR2、Cyclin B1和p-CDK1分别极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05）升高。根据所得结果表明,过表达miR-155-5p促进猪卵丘细胞的扩散和卵母细胞体外成熟;miR-155-5p调控CX43基因的表达,激活了猪卵母细胞的减数分裂;miR-155-5p调控CX43-c AMP-MPF通路,推测miR-155-5p可能通过此通路调节猪卵母细胞的体外成熟。
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