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目的:采用不同浓度的复方中药乳康饮分组干预体外培养的Vγ9Vδ2-T细胞,探讨乳康饮对体外培养的人Vγ9Vδ2-T细胞的活性、增殖、细胞免疫表型和抗三阴性乳腺癌细胞活性的影响,并探究其可能的作用机制。通过构建三阴性乳腺癌动物模型,以乳康饮联合Vγ9Vδ2-T细胞过继输注的方式干预,探讨乳康饮体外活化的Vγ9Vδ2-T细胞过继回输到体内后,对三阴性乳腺癌肿瘤的治疗作用,为临床上联合乳康饮和Vγ9Vδ2-T细胞过继免疫治疗三阴性乳腺癌提供实验研究依据。方法:第一部分取健康志愿者静脉血,分离提取PBMC后,使用不同浓度乳康饮联合IL-2干预处理PBMC,CCK-8法检测乳康饮对人PBMC的细胞毒性作用;采用Zol联合IL-2体外扩增PBMC中的Vγ9Vδ2-T细胞,设置不同浓度的乳康饮对Vγ9Vδ2-T细胞的体外扩增进行干预。扩增两周后,使用流式细胞分析仪检测Vγ9Vδ2-T细胞在体外扩增体系中的百分率、细胞绝对数目以及细胞活性;将不同浓度乳康饮培养的Vγ9Vδ2-T细胞使用流式细胞分选仪进行分选纯化后,糖酵解速率实验检测乳康饮对Vγ9Vδ2-T细胞糖酵解能力的影响。第二部分将各组经不同浓度乳康饮处理的Vγ9Vδ2-T细胞分选纯化后,分别与三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549按10:1效靶比共孵育8小时后,乳酸脱氢酶实验检测Vγ9Vδ2-T细胞杀伤三阴性乳腺癌细胞的效率;为了深入研究乳康饮对Vγ9Vδ2-T细胞抗肿瘤活性调控的具体杀伤分子机制,我们检测了Vγ9Vδ2-T细胞的免疫表型及细胞因子分泌,Real-time PCR检测T-bet,GATA3 m RNA表达水平,通过RNA测序的方法,找到乳康饮多途径多靶点调控Vγ9Vδ2-T细胞抗三阴性乳腺癌肿瘤细胞活性的靶标信号通路和差异性基因。第三部分体外实验选取重度免疫缺陷的B-NDG小鼠,构建三阴性乳腺癌荷瘤小鼠模型,成瘤14天后将三阴性乳腺癌荷瘤小鼠分为三组:PBS组、Vγ9Vδ2-T细胞组、乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组。PBS组给予PBS尾静脉回输,Vγ9Vδ2-T细胞组给予体外扩增培养14天的Vγ9Vδ2-T细胞尾静脉回输、乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组给予乳康饮体外扩增培养14天的Vγ9Vδ2-T细胞进行尾静脉回输,分别于肿瘤成瘤的第14天、21天、28天给予小鼠尾静脉回输过继治疗,实验过程中动态监测小鼠体内Vγ9Vδ2-T细胞、肿瘤及体重变化,3次过继回输治疗后处理小鼠。利用HE染色法观察小鼠肿瘤及重要脏器的情况。使用流式细胞分析仪检测Vγ9Vδ2-T细胞在小鼠外周血及脾脏的存活比例,采用多重免疫组化法,检测乳康饮对Vγ9Vδ2-T细胞在三阴性乳腺癌肿瘤中浸润的影响。结果:第一部分（1）乳康饮100 ng/ml及200 ng/ml分别联合IL-2作用于PBMC的第6天,能够促进PBMC的增殖,在显微镜下可观察到,加入乳康饮处理的Vγ9Vδ2-T细胞集落生长更明显。（2）唑来膦酸联合IL-2可用于体外扩增Vγ9Vδ2-T细胞;不同浓度的乳康饮体外处理Vγ9Vδ2-T细胞的实验发现,虽然Vγ9Vδ2-T细胞在扩增的百分率上没有差异,但扩增细胞绝对数量在扩增过程的14天有差异,乳康饮各处理组均呈现上升趋势,50 ng/ml乳康饮处理组和200 ng/ml乳康饮处理组细胞扩增数目与空白对照组相比,有统计学差异（P＜0.05）,100 ng/ml乳康饮处理组细胞扩增数目与空白对照组相比,上升最明显,有显著差异（P＜0.01）。流式细胞分析实验结果显示:乳康饮50 ng/ml组、乳康饮100 ng/ml组、乳康饮200 ng/ml组体外干预细胞14天后,与空白对照组相比,均显著降低了体外培养Vγ9Vδ2-T细胞的凋亡（P＜0.001）,提高了体外培养扩增Vγ9Vδ2-T细胞的活性。（3）使用海马细胞能量代谢仪检测发现:乳康饮提高了Vγ9Vδ2-T细胞的糖酵解速率。第二部分（1）用不同剂量乳康饮处理Vγ9Vδ2-T细胞14天后,分别与MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549共孵育8 h后,检测Vγ9Vδ2-T细胞对三阴性乳腺癌细胞的杀伤率,发现未使用乳康饮处理的Vγ9Vδ2-T细胞对三种TNBC细胞的杀伤能力存在差异,Vγ9Vδ2-T细胞对BT-549细胞的杀伤作用最明显,杀伤率为38.92%±4.34%,Vγ9Vδ2-T细胞对MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞的杀伤无统计学差异。乳康饮100 ng/ml及乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞对MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549细胞的杀伤能力,乳康饮100 ng/ml组显著增强了Vγ9Vδ2-T细胞对MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞的杀伤能力（P＜0.01）,乳康饮200ng/ml组与空白对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组相比,乳康饮50 ng/ml组也增强了Vγ9Vδ2-T细胞对MDA-MB-231细胞、BT-549细胞的杀伤能力（P＜0.05）。（2）通过检测乳康饮处理扩增14天后的Vγ9Vδ2-T细胞表面和胞内分子标志,发现乳康饮50 ng/ml组、乳康饮100 ng/ml组、乳康饮200 ng/ml组上调了Vγ9Vδ2-T细胞活化相关表面分子NKG2D的表达（P＜0.001）以及胞内的颗粒酶B、IFN-γ、TNF-α的表达水平（P＜0.01）,下调了免疫耗竭相关蛋白PD-1（P＜0.01）及凋亡相关蛋白FAS的表达。乳康饮100 ng/ml组与对照组相比,还提高了Vγ9Vδ2-T细胞穿孔素的表达（P＜0.01）。（3）在Vγ9Vδ2-T细胞与MDA-MB-231细胞共培养上清中,乳康饮50 ng/ml、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的IFN-γ水平（P＜0.0001,P＜0.01,P＜0.01）,乳康饮50 ng/ml、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml也提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的TNF-α（P＜0.05）。在Vγ9Vδ2-T细胞与MDA-MB-468细胞共培养上清中,与对照组相比,乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的IFN-γ水平（P＜0.05）,乳康饮100 ng/ml组、乳康饮200 ng/ml组与乳康饮50 ng/ml组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。乳康饮50 ng/ml、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的TNF-α（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.05）,乳康饮50 ng/ml组与乳康饮100 ng/ml组相比,差异有显著统计学意义（P＜0.001）。在Vγ9Vδ2-T细胞与BT-549细胞共培养上清中,乳康饮50 ng/ml组、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的IFN-γ水平（P＜0.01）,乳康饮50 ng/ml、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml也提高了Vγ9Vδ2-T细胞分泌的TNF-α（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05）,乳康饮50 ng/ml组与乳康饮100 ng/ml组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）与对照组相比,乳康饮50 ng/ml、乳康饮100 ng/ml、乳康饮200 ng/ml提高了Vγ9Vδ2-T细胞T-bet m RNA的表达水平（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.05）。与对照组相比,乳康饮100 ng/ml降低了Vγ9Vδ2-T细胞GATA-3 m RNA的表达（P＜0.01）。（5）RNA测序结果显示乳康饮调节Vγ9Vδ2-T细胞在T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路相关基因的表达。第三部分（1）体内实验检测:在过继回输治疗27天后,与PBS组相比,Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠肿瘤体积减小（P＜0.001）,乳康饮预处理的Vγ9Vδ2-T细胞组肿瘤体积显著变小（P＜0.0001）。过继回输治疗21天后乳康饮预处理的Vγ9Vδ2-T细胞组抗三阴性乳腺癌肿瘤效果优于Vγ9Vδ2-T细胞组（P＜0.05）。（2）HE检测结果:PBS组肿瘤组织细胞排列紧密,Vγ9Vδ2-T细胞组及乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组,肿瘤组织中均出现坏死区域。（3）多重免疫组化检测结果发现:与PBS组相比,回输乳康饮预处理的Vγ9Vδ2-T细胞组的CD3+T细胞比例最高,有显著统计学的差异（P＜0.001）,单纯使用Vγ9Vδ2-T细胞组的CD3+T细胞也高于PBS组（P＜0.01）,乳康饮预处理的Vγ9Vδ2-T细胞组CD3+T细胞高于单纯使用Vγ9Vδ2-T细胞组（P＜0.01）。（4）流式细胞术检测结果:在第三次过继回输治疗后的第10天,可以检测到Vγ9Vδ2-T细胞组和乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠脾脏中的Vγ9Vδ2-T细胞,并且在乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠脾脏中,Vγ9Vδ2-T细胞比例更高。（5）在三次过继回输治疗后的第10天,检测小鼠外周血中存活的Vγ9Vδ2-T细胞发现:与单纯回输Vγ9Vδ2-T细胞组相比,乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠外周血中存活的Vγ9Vδ2-T细胞显著高于单纯回输Vγ9Vδ2-T细胞组,有显著的统计学差异（P＜0.0001）。（6）向三阴性乳腺癌荷瘤小鼠体内过继回输Vγ9Vδ2-T细胞和乳康饮预处理的Vγ9Vδ2-T细胞展现出良好的体内安全性,对照组、Vγ9Vδ2-T细胞组和乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠的体重无差异。HE染色结果显示:Vγ9Vδ2-T细胞组、乳康饮预处理Vγ9Vδ2-T细胞组小鼠心脏、肝脏、肾脏均无内脏器官的损伤。结论:1乳康饮在一定浓度范围可促进Vγ9Vδ2-T细胞在体外的扩增,提高体外培养Vγ9Vδ2-T细胞的活性及糖酵解速率。2乳康饮可能通过上调Vγ9Vδ2-T细胞活化相关受体及T-bet的表达水平,促进Vγ9Vδ2-T细胞活化,分泌较高水平INF-γ、TNF-α、颗粒酶B、穿孔素以及下调T细胞耗竭相关蛋白PD-1的表达,增强Vγ9Vδ2-T细胞对三阴性乳腺癌肿瘤细胞的杀伤能力。3乳康饮增强了Vγ9Vδ2-T细胞体内抗三阴性乳腺癌肿瘤的作用,抑制三阴性乳腺癌肿瘤的生长,并促进了Vγ9Vδ2-T细胞在肿瘤中的浸润。4乳康饮提高了过继回输Vγ9Vδ2-T细胞体内外周血存活比例及脾脏积聚能力,并且具有一定的体内安全性。